LncRNA SNHG1在同型半胱氨酸致足细胞焦亡中的作用

张正皓 马芳 张晴 夏童童 刘虹麟，3 白志刚，4 卢冠军，5 张竞文 彭红建，6 姜怡邓 马胜超，3

宁夏医科大学1基础医学院，3检验学院 （银川 750004）；2国家卫生健康委员会代谢性心血管疾病研究重点实验室 （银川 750004）；4宁夏回族自治区人民医院 （银川 750004）；5宁夏医科大学总医院 （银川 750004）；6中南大学化学化工学院 （长沙 410083）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）作为慢性肾脏疾病患者心血管疾病的独立危险因素，由蛋氨酸和半胱氨酸共同代谢形成。肾脏是Hcy重要代谢场所之一，当血清中Hcy含量超过15 μmol/L即可诊断为高同型半胱氨酸血症（hyperhomocyste⁃inemia，HHcy）。HHcy引起肾小球受损和肾脏功能下降进而导致慢性肾炎、慢性肾功能不全等肾病综合征［1］，终末期肾脏疾病患者中HHcy的发病率高达85%［2］。足细胞是肾小球滤过膜的主要组成部分，其功能是维持体内水、电解质和代谢物的稳态，足细胞的功能障碍或损伤是肾小球疾病的主要病理基础之一［3］。足细胞焦亡将导致足细胞数量减少，裂孔膜破坏、足突融合和蛋白尿产生，最终引起肾损伤，但是其作用机制还尚未清楚。有研究［4］显示Hcy水平升高可导致足细胞的损伤，致使其功能障碍，但Hcy能否引起足细胞发生焦亡及其作用机制目前尚未阐明。因此，深入探究足细胞发生焦亡的作用机制，将对未来防治肾脏疾病的发生发展有重要意义。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，ln⁃cRNA）作为转录因子和染色体的修饰因子，通常与DNA、RNA和蛋白质相互作用调节基因表达和表观遗传学修饰。lncRNA细胞功能多样，如调节细胞周期、细胞分化、细胞焦亡、信号传递等多个方面。核仁小RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene1，SNHG1），在人类基因组中位于11q12.3位置，在多种疾病发生过程中扮演重要角色。CUI 等［5］研究发现，过表达lncSNHG1能够有效抑制miR-101-3p的表达水平，激活下游Wnt/β-catenin信号转导通路，从而影响非小细胞肺癌的的发生发展；此外，肾癌组织中lncSNHG1呈高表达，lnc⁃SNHG1敲除后能够抑制肾癌增殖、侵袭和上皮间质转化（EMT）的作用也被相继报道［6］。然而关于lncSNHG1在Hcy诱导足细胞焦亡的作用机制尚未报道。因此，本研究观察和分析lncSNHG1的表达及其对足细胞焦亡的作用，探讨lncSNHG1在Hcy诱导足细胞发生焦亡中的具体作用，将为Hcy引起的肾损伤提供潜在靶向预防和治疗新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验试剂及仪器细胞株：小鼠肾小球细胞株（MPC-5）由宁夏医科大学病理生理学系惠赠；同型半胱氨酸（美国，Sigma）；胎牛血清、DMEM高糖培养基（美国，Gibco）；青链霉素、胰蛋白酶消化液（北京，索莱宝）；超净工作台（苏州，安泰空气技术）；细胞恒温培养箱（德国，Heraeus）；5415D微型离心机（德国，Eppendorf）；总蛋白提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、蛋白上样缓冲液（江苏，凯基生物）；总RNA提取试剂盒（北京，天根生化）；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒（日本，TaKaRa）；小鼠GAPDH内参引物及lncSNGH1上下游引物（上海，生工生物工程）；实时荧光定量分析仪（德国，耶拿）；激光共聚焦显微镜（德国，ZEISS）；电泳仪、电转仪及凝胶成像仪（美国，Bio-Rad）；荧光显微镜（日本，Olympus）；酶标仪（美国，BioTek）；ELISA IL-1β、IL-18炎症因子试剂盒（上海，科艾博生物）；Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3抗体（美国，Cell Signaling Technology）、GSDMD、GSDMDN抗体（江苏，Affinity）；辣根过氧化物酶（HRP）、荧光羊抗兔二抗（北京，博奥森）；β-actin抗体（武汉，爱博泰克）。

1.1.2 实验动物SPF级18只雄性杂合子Cbs+/-小鼠购自美国Jackson实验室，体质量25～30 g，8周龄，合格证号：SCXK（京）2016-0006，小鼠饲养于宁夏医科大学动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 动物及分组选取18只Cbs+/-小鼠随机分成两组（每组9只），设置正常饮食组（ND）和高蛋氨酸饮食组（HMD），正常饮食中加入2%蛋氨酸。昼夜节律12 h，室内环境温度（25±2） ℃，相对湿度60%，每2天更换饲养笼1次，喂养8周后进行实验。

1.2.2 细胞培养及分组足细胞采用DMEM（高糖）培养基（含10%胎牛血清、100U/L青霉素和0.1 g/L链霉素）培养，条件：37 ℃、5% CO2。细胞密度达80%时，设置对照组（Control，0 μmol/L Hcy）和同型半胱氨酸干预组（Hcy，80 μmol/L Hcy），干预细胞48 h后，检测焦亡相关指标。

1.2.3 细胞转染及分组依照过表达慢病毒载体试剂盒说明书按步骤培养足细胞至对数生长期，细胞密度达40%时进行转染。设置对照组（Con⁃trol）、lncSNHG1过表达阴性对照组（OE-NC）和lnc⁃SNHG1过表达组（OE-SNHG1）；转染后同型半胱氨酸干预细胞，设置lncSNHG1过表达阴性对照+同型半胱氨酸干预组（OE-NC+Hcy）和lncSNHG1过表达+同型半胱氨酸干预组（OE-SNHG1+Hcy）。干预细胞48 h后进行后续实验。

1.2.4 过表达慢病毒载体构建效果鉴定lncSNHG1过表达慢病毒转染至足细胞72 h后，通过荧光显微镜下观察足细胞绿色荧光情况；qRT-PCR法检测足细胞中lncSNHG1表达水平。

1.2.5 qRT⁃PCR法检测lncRNA SNHG1表达水平依据RNA提取试剂盒说明书分别提取各组细胞总RNA，取2 μg总RNA为模板逆转录成cDNA，进行qRT-PCR检测。Gene Bank数据库查询lncSNHG1基因序列并设计引物（上海，生工生物工程）合成。lncSNHG1引物序列Forward；5′-TCCTT⁃GTTCGGGGTTTGAGG-3′，Reverse：5′-ACAGCACCCTGACTACAAGC-3。GADPH引物序列Forward；5′-ACCCAGAAGACTGTGGAGG-3′，Reverse：5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3′。逆转录反应体系：PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix×4 1.0 μL、5× PrimeScriptBuffer2（For Real Time） 4.0 μL、RNase Free dH2O 4.0 μL；PCR反应体系：TBGreen 10 μL、上下游引物各0.8 μL、RNase Free dH2O 6.4 μL、逆转录产物2 μL；lnc SNHG1荧光定量PCR扩增条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、57.8 ℃ 34 s，共35个循环。以小鼠GADPH内参基因为对照，目的基因相对量根据公式2-ΔΔCt分析lnc SNHG1的表达。公式如下：ΔΔCt=［Ct目的基因（对照组）-Ct内参基因（对照组）-］-［（Ct目的基因（实验组）-Ct内参基因（实验组）］，2-ΔΔCt表示的是目的基因表达量相对于对照组的变化倍数，实验重复3次。

1.2.6 Western blot法检测Caspase⁃1、Cleaved Caspase⁃1、NLRP3蛋白表达水平依据分组收取细胞，根据凯基蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白样品浓度。上样蛋白经SDS⁃PAGE凝胶电泳90 V 20 min，120 V 30 min湿转2 h转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉的PBST封闭4 h，PBST洗膜10 min × 3次；依次加入Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3特异性一抗（1∶1 000）4 ℃摇床孵育过夜；次日加入HRP标记的兔二抗（1∶5 000），室温摇床孵育2 h，PBST洗膜10 min × 3次；ECL试剂盒发光显色，凝胶成像仪进行成像分析。Image Lab软件分析灰度值，以β-actin为内参对照，计算Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3蛋白与β⁃actin内参灰度值的比值做定量分析。

1.2.7 ELISA法检测白细胞介素IL⁃1β、IL⁃18含量依据分组处理细胞，设置标准品孔和样本孔，各加不同浓度的标准品50 μL，样品稀释液40 μL及待测样品10 μL；每孔加酶标试剂100 μL，空白孔除外；封板膜封板60 min；弃去液体，甩干，每孔加洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次；每孔加显色剂37 ℃避光显色15 min后加终止液50 μL；以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 免疫荧光法检测GSDMD、GSDMD⁃N表达足细胞密度达50%铺皿，同型半胱氨酸干预细胞48 h后收皿，4%多聚甲醛固定细胞30 min，山羊血清封闭30 min，配置GSDMD、GSDMD-N特异性抗体（1∶200）4 ℃摇床孵育过夜，次日加入FITC荧光标记二抗避光孵育60 min，细胞核染色避光孵育5 min，使用激光共聚焦取视野拍照采取图像。

1.3 统计学方法实验数据应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，GraphPad Prism 8.0软件进行制图。结果采用（）表示，并满足方差齐性。两组间数据比较采用独立样本t检验；多组间数据比较采用单因素方差分析（One-way A NOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高蛋氨酸小鼠肾脏组织中焦亡相关蛋白的表达水平Western blot检测Cbs+/-小鼠肾脏组织中的焦亡相关蛋白表达水平。实验结果显示：与ND组相比较，HMD组中Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3蛋白表达水平增高（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

图1 检测ND、HMD组中的焦亡蛋白表达Fig.1 Detection of the expression of pyroptosis in ND and HMD groups

2.2 同型半胱氨酸对足细胞焦亡的影响Western blot和免疫荧光分别检测了足细胞中焦亡蛋白表达水平，使用ELISA检测焦亡介导的炎症因子含量。Western blot实验结果显示：与Control组相比较，Hcy组中焦亡蛋白Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3表达水平增高（P＜0.05，P＜0.01）；免疫荧光结果显示：与Control组相比较，Hcy组中焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-N表达水平增高；ELISA结果显示：与Control组相比较，Hcy组中焦亡介导的炎症因子IL-1β和IL-18的含量增高（P＜0.01）。见图2。

2.3 同型半胱氨酸对lncRNA SNHG1表达水平的影响qRT⁃PCR法检测了足细胞中lncSNHG1的表达水平，结果显示：与Control组相比较，Hcy组中lncSNHG1的表达水平增高（P＜0.01）。见图3。

图3 LncSNHG1在Hcy干预的足细胞中高表达Fig.3 LncSNHG1 is High-expression in homocysteine intervention podium

2.4 过表达lncRNA SNHG1慢病毒载体构建为了探究过表达lncSNHG1慢病毒载体在足细胞中是否构建成功。通过镜下观察足细胞转染的绿色荧光，qRT⁃PCR法检测足细胞中lncSNHG1表达水平。结果显示：慢病毒转染至足细胞72 h后，可见较强绿色荧光，转染效率＞80%；qRT⁃PCR法结果显示：与Control组和OE-NC组相比较，OE-SNHG1组中lncSNHG1的表达水平增高（P＜0.01）。以上实验结果提示慢病毒载体在足细胞中构建成功，可用于后续实验。见图4。

图4 过表达慢病毒lncSNHG1载体构建结果Fig.4 Construction of lentivirus overexpressed lncSNHG1

2.5 过表达lncRNA SNHG1对同型半胱氨酸诱导的足细胞焦亡的影响Western blot和免疫荧光技术分别检测了足细胞中的焦亡蛋白表达水平，使用ELISA检测焦亡介导的炎症因子含量。Western blot实验结果显示：与OE-NC+Hcy组相比较，OE-SNHG1+Hcy组中焦亡蛋白Caspase-1、Cleaved Caspase-1及NLRP3表达水平增高（P＜0.05，P＜0.01）；免疫荧光结果显示：与OE-NC+Hcy组相比较，OE-SNHG1+Hcy组中焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-N表达水平增高；ELISA结果显示：与OENC+Hcy组相比较，OE-SNHG1+Hcy组中焦亡介导的炎症因子IL-1β和IL-18的含量增高（P＜0.01）；见图5。

图5 检测OE-NC+Hcy、OE-SNHG1+Hcy组中的焦亡相关指标的表达Fig.5 Detection of the expression of pyroptosis related indicators in OE-NC+Hcy and OE-SNHG1+Hcy groups

3 讨论

慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）指多种原因导致肾脏结构和功能发生异质性疾病的总称。CKD主要特征是通过炎症、纤维化和高滤过等过程损害肾小球、血管供应和肾小管间质。足细胞是肾小球有丝分裂后高度分化的上皮细胞，通过血浆蛋白和肾小球基底膜之间的支撑作用过滤血浆，在维持肾小球滤过屏障功能和结构方面发挥重要作用［7］。当足细胞损伤或功能发生障碍时会引起细胞内信号通路异常、基质增生和炎症反应使肾小球滤过膜破坏，进而导致慢性肾脏疾病［8］。有文献［9］报道，肾脏是Hcy代谢途径之一，因此Hcy与慢性肾脏疾病发生发展密切关联，所以Hcy可以作用于足细胞并引起肾小球结构损伤和功能障碍，但具体作用机制尚未明确。

细胞焦亡（pyroptosis）是近年来新发现的一种依赖Caspase蛋白，伴随炎症反应的特殊程序性细胞死亡。细胞焦亡通过清除病原体或产生炎性信号来保护机体，当细胞受到外界刺激或内源性信号的作用下，导致疾病的发生发展［10］。经典细胞焦亡信号通路，由活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）切割并激活成孔细胞通透性蛋白gasdermin-D在细胞膜上成孔、细胞肿胀、质膜破裂，继而释放炎性胞质内容物IL-1β、IL-18和其他物质，导致细胞膜破裂引起炎性反应［11-12］。实验结果显示，高蛋氨酸饮食小鼠肾脏组织焦亡相关蛋白表达增高；体外80 μmol/L Hcy干预足细胞48 h后Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3和GSDMD、GSDMD-N表达增高，焦亡介导的炎症因子IL-1β、IL-18含量增高。提示Hcy可以诱导足细胞发生焦亡进而引起足细胞损伤。但Hcy具体通过何种途径诱导足细胞发生焦亡尚未明确。

长链非编码RNA在人类疾病中已成为新的生物标记物和治疗靶点，长链非编码核仁小分子RNA宿主基因1在多种疾病组织中具有显著特异性，广泛参与人体生理调节、细胞增殖、凋亡和转移等生物学过程，在调控疾病发生发展有着重要作用［13］。ZHANG等［14］研究发现，SNHG1通过抑制miR-195-5p的表达来促进肝脏癌细胞的增殖、侵袭和转移。LEI等［15］在对骨关节炎的研究中证实，SNHG1可介导p38 MAPK-NF-κB信号通路减缓骨关节炎的代谢功能障碍与炎性状态，并提出SNHG1可以缓解骨关节炎的进展。XU等［16］发现SNHG1基因敲除可抑制肌层浸润性膀胱癌癌细胞的侵袭。另有研究者通过GEO数据库的分析显示，SNHG1在肾癌细胞系中呈现高表达，且与肾癌患者预后不良相关［17］。在本实验中发现，Hcy诱导的足细胞lncSNHG1表达增高；过表达lnc⁃SNHG1后足细胞中Caspase-1、Cleaved Caspase-1、NLRP3和GSDMD、GSDMD-N表达增高，焦亡介导的炎症因子IL-1β、IL-18含量增加。提示，在Hcy诱导足细胞发生焦亡过程中，过表达lncSNHG1可以进一步促进足细胞发生焦亡，进而加速肾脏损伤。

综上所述，lncSNHG1在慢性肾脏疾病中介导的分子功能和细胞机制是复杂的，涉及多个因素。这些分子机制对泌尿生殖系统的临床诊断、治疗和预后有重要意义。本文首次探究了lncSNHG1在Hcy诱导的足细胞焦亡中的具体调控作用。提示lncSNHG1可作为慢性肾脏疾病的一种新型靶向标记，为进一步研究足细胞焦亡的具体作用机制提供了新的实验依据。考虑本次实验条件存在局限性，随着基因组学技术的不断发展，将在今后的实验中进一步体内验证lncSNHG1在HHcy致肾损伤中的作用，阐明足细胞焦亡引起肾功能障碍的分子机制，为进一步治疗HHcy引起的肾损伤提供理论依据。