以全蛋为原料制备双蛋白发酵乳工艺优化

吕凯波，巢诚，张星雨，夏卿，徐文广，陈静，张芳芳

（1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300457；2.武汉工商学院 环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065）

双蛋白食品是以优质动植物蛋白为主要营养基料配制研发的新型营养食品[1]，《国民营养计划（2017-2030 年）》指出要着力发展双蛋白食品，实施“中国特色双蛋白工程”[2-3]。双蛋白食品具有促进肌肉蛋白的合成、增强免疫力、调节骨脂代谢等功效[4-5]，而蛋白质分子经过发酵更易被人们消化和吸收，具有改善肠道健康、缓解乳糖不耐症等功能[6-8]。鸡蛋中含有丰富的蛋白质，生物价可达94%，营养学家称之为标准蛋白质[9-10]。鸡蛋煮熟并酶解后具有较强抗氧化能力并能有效减少过敏反应[11-12]，是蛋白质食品的优质原料。

近几年国内对双蛋白食品的研究逐渐增多，如大豆玉米双蛋白[13]、刺梨双蛋白奶制品[14]、花生双蛋白发酵乳[15]等，多是在豆乳和牛乳的基础上添加其他植物蛋白或适量风味物质调配而成，产品原料和加工方式比较单一，以鸡蛋或其酶解液作为原料制备双蛋白食品工艺鲜有报道。

牛奶中钙含量高，能有效弥补鸡蛋液中钙含量较低的问题；鸡蛋通过酶解后与豆浆混合发酵可有效掩盖蛋腥味，解决豆浆中蛋氨酸不足的问题。鸡蛋酶解液、豆浆、牛奶共同作为原料，其发酵产品既能具有高钙高蛋白的营养性又能具有较好的口感。本试验以鸡蛋酶解液、豆浆和牛奶为原料，通过单因素和正交试验得出最佳发酵条件，以期为丰富新产品研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆（十月稻田黄豆）、鸡蛋、全脂灭菌纯牛奶：市售；中性蛋白酶（5 万U/g）：圣斯德有限公司；佰生优酸奶发酵菌（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌质量比为10∶3∶4）：善恩康生物科技（苏州）有限公司；石油醚（分析纯）：天津市永大化学有限公司；D-异抗血酸钠、β-环糊精、羧甲基纤维素钠、卡拉胶（均为食品级）：富康生物有限公司；硼酸、氨水、氢氧化钠、硫酸、盐酸、酚酞（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；甲基红、亚甲基蓝、七水硫酸钴（均为分析纯）：天津市百世化工有限公司；硫酸铜（分析纯）：天津市河北区海晶精细化工厂；硫酸钾（分析纯）：北京亚太龙兴化工有限公司；甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（glycine-glycine-tyrosine-arginine，Gly-Gly-Tyr-Arg）标准品（纯度≥95%）：Sigma 公司；胰蛋白酶（2 000 U/g）：杭州三叶生物化工厂；Protamex 复合蛋白酶（150 000 U/g）：Novozyme 公司。

1.2 仪器与设备

DJ12B-A605SG 豆浆机：九阳股份有限公司；JM2002电子分析天平：上海轩澄仪器有限公司；HN25S 恒温培养箱：北京市恒诺利兴科技有限公司；UV-9100 紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；BO220 恒温水浴锅：上海试验仪器厂有限公司；GZX-9420MBE 电热恒温鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LD5-2A 低速离心机：北京医用离心机厂。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解液的制备

鸡蛋洗净煮熟后冷却剥壳碾碎，与水按质量比3∶7（即鸡蛋质量分数为30%）混合搅拌均匀过50 目筛，按0.3 g/100 mL 比例加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解2 h，95 ℃灭活30 min 后得到鸡蛋酶解液备用[16]。

1.3.2 豆浆的制备

将黄豆干豆浸泡24 h 后，干豆与水按质量比1∶8放入豆浆机煮沸研磨，冷却过滤得到豆浆备用[16]。

1.3.3 发酵乳制备工艺

将鸡蛋酶解液、豆浆和牛奶按一定比例混合制备双蛋白发酵原料液，发酵制得双蛋白发酵乳，加入添加剂调配得到成品[16]。具体工艺见图1。

图1 发酵乳制备工艺Fig.1 Preparation process of fermented milk

1.3.4 双蛋白发酵乳发酵工艺研究

1.3.4.1 鸡蛋酶解液、豆浆、牛奶比例筛选

在蔗糖添加量为8%（质量分数）、发酵菌接种量为12%、发酵温度为40 ℃、发酵时间为4 h 条件下发酵，考察鸡蛋酶解液、豆浆、牛奶不同占比对感官评分的影响。

1.3.4.2 发酵单因素试验

在鸡蛋酶解液、豆浆、牛奶体积比为1∶3∶1 时，考察蔗糖添加量、发酵菌接种量、发酵温度、发酵时间4个因素对双蛋白发酵乳感官评分的影响。

蔗糖添加量的影响：在发酵菌接种量为12%、发酵温度为40 ℃、发酵时间为4 h 条件下，考察蔗糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）（质量分数）对感官评分的影响。

发酵菌接种量的影响：在蔗糖添加量为8%（质量分数）、发酵温度为40 ℃、发酵时间为4 h 条件下，考察发酵菌接种量（6%、8%、10%、12%、14%）对感官评分的影响。

发酵温度的影响：在蔗糖添加量为8%（质量分数）、发酵菌接种量为12%、发酵时间为4 h 条件下，考察发酵温度（39、41、43、45、47 ℃）对感官评分的影响。

发酵时间的影响：在蔗糖添加量为8%（质量分数）、发酵菌接种量为12%、发酵温度为40 ℃条件下，考察发酵时间（2、3、4、5、6 h）对感官评分的影响。

1.3.4.3 发酵正交试验设计

根据单因素试验结果，选择蔗糖添加量、发酵菌接种量和发酵时间3 个因素，以感官评分作为考察指标，按表1 设计L9（33）的正交试验，确定最佳发酵工艺。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 双蛋白发酵乳的调配

经反复筛选，加入D-异抗坏血酸钠0.10%、β-环糊精0.15%、羧甲基纤维素钠0.20%、卡拉胶0.10%，将其中一个因素添加量设置为0.10%、0.15%、0.20%，其他因素不变，考察其持水率、感官评分、酸度，以感官评分为指标确定添加剂的用量。

1.3.6 感官评价

每次组织品评人10 名，男女各半，参照文献[17]并稍作修改制定评分标准，见表2，从色泽、气味与滋味、组织状态、杂质四方面对产品品质进行评价，采用百分制计算评价结果[18]。

表2 发酵乳的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented milk

1.3.7 产品品质分析指标

持水率的测定参照文献[18]的方法并稍作修改，取10 mL 样品放入离心管，离心管质量记w1（g），加入样品后的质量记为w2（g），离心速度为6 000 r/min，离心10 min，静置10 min，吸去上清液，此时质量记为w3（g）。持水率（M，%）计算公式如下。

酸度参照GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》[19]中的方法进行测定。

脂肪含量参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》[20]中索氏抽提法进行测定。

非脂乳固体含量参照GB 5413.39—2010《食品安全国家标准乳和乳制品中非脂乳固体的测定》[21]进行测定。

蛋白质含量参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》[22]中凯氏定氮法进行测定。

多肽含量的测定：参照文献[23]的方法测定，用三氯乙酸法沉淀大分子蛋白质离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，540 nm 下测定其OD 值，测得Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽标准曲线为y=0.368 1x+0.001 2（R2=0.999 7），根据标准曲线计算多肽含量。

1.4 数据处理

试验重复3 次，结果以平均值和标准差表示，采用Excel 2016 计算作图，SPSS 27 统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 双蛋白发酵液制备及发酵工艺优化

2.1.1 鸡蛋酶解液、豆浆、牛奶体积比筛选

在蔗糖添加量为8%（质量分数）、发酵菌接种量为12%、发酵温度为40 ℃、发酵时间为4 h 条件下，根据1.3.3 制备双蛋白发酵乳，其感官评分见表3。

表3 双蛋白发酵液组成比例及感官评分结果Table 3 Composition ratio and sensory evaluation of the double protein fermented milk

由表3 可知，当鸡蛋酶解液添加量占比40% 以上时，改变另外两个原料比例，评分均在75.00 分以下，表现为气味与滋味较差，可能是因为酶解液过多使发酵乳具有明显蛋腥味。

当鸡蛋酶解液添加量占比40% 以下且豆浆占比40% 以下时，其气味与滋味得分变化不明显，但组织状态得分较高。可能是鸡蛋中低密度脂蛋白、卵黄球蛋白等会在加热变性过程中增强分子间疏水作用，形成凝胶，因此发酵乳状态均一，组织状态得分较高[24]。当鸡蛋酶解液添加量占总比40% 以下且豆浆占比40%以上时，其牛奶与鸡蛋酶解液加入量相等，发酵乳气味与滋味、杂质得分较优，而组织状态得分较低。推测可能是牛奶与鸡蛋等量混合，鸡蛋酶解液中干物质含量高，体系不能很好地其起到稀释作用，致使组织状态不均一。

当鸡蛋酶解液添加量占比40% 时，豆浆与牛奶在不同比例下得分变化较大，当三者体积比为2∶1∶2 时，杂质得分较高，因为此比例下鸡蛋酶解液与牛奶等量混合，稀释了鸡蛋酶解液中的干物质，故杂质减少；当三者体积比为2∶2∶1 时气味与滋味分值较低，此比例下虽然酸甜不协调但具有特殊风味，推测是因为鸡蛋酶解液与豆浆发酵后形成了特殊风味，但牛奶含量较少，总体系不能满足发酵菌所需营养，使得发酵后所得发酵乳酸味过大；当三者体积比为2∶1∶2 时，得到感官较好的发酵乳。

综合上述情况，第5、6、8 组总分相对较高，但考虑到原料制作成本问题，豆浆成本价格相比另外两种原料价格更低廉，且发酵乳的组织状态可以通过后期调配得到改善，故选取第8 组，即鸡蛋酶解液∶豆浆∶牛奶体积比为1∶3∶1 进行后续试验。

2.1.2 双蛋白发酵液的发酵工艺

按1.3.4 的方法制备发酵乳，考察蔗糖添加量、发酵菌接种量、发酵温度、发酵时间对感官评分的影响，结果如图2~图5 所示。

图2 蔗糖添加量对感官评分的影响Fig.2 Effect of sucrose supplementation on sensory evaluation

图3 发酵菌接种量对感官评分的影响Fig.3 Effect of fermentative bacteria inoculation amount on sensory evaluation

图4 发酵温度对感官评分的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation

图5 发酵时间对感官评分的影响Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation

由图2 可知，随蔗糖添加量的增加感官评分先上升后下降，当蔗糖添加量在8%（质量分数）时感官评分最高为80.53。发酵过程中菌种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌将碳源适量水解成有机酸，发酵乳酸甜得当，口感更好[25]。当加入蔗糖过高时，体系产生较高渗透压，抑制发酵菌种的生长繁殖，发酵能力下降，产品滋味和组织形态变差，使感官评分下降。故选取蔗糖添加量7%、8%、9%（质量分数）进行后续试验。

由图3 可知，在发酵菌接种量为10% 时感官评分最高为81.63，随后迅速下降。发酵菌接种量较少时，发酵产酸量较低，影响整体口感层次；而发酵菌接种量过多，体系酸度过大，造成发酵乳口感较差的同时产品组织状态有分层现象，感官评分较低[26]。故发酵菌接种量在10% 左右较为适宜。

由图4 可知，发酵温度在43 ℃时感官评分最高为82.86，随后快速下降，一般发酵乳的最适温度为42 ℃左右[25-26]，但Hu 等[27]研究发现加有大豆蛋白的发酵乳最佳发酵温度高于普通牛奶发酵乳，双歧杆菌与嗜热链球菌加入豆浆后菌群改变，导致发酵最适温度增加。由于鸡蛋液在高温下其表面疏水性和乳化稳定性增强[28]，因此发酵乳感官评分上升。故发酵温度为43 ℃时呈现出来产品的口感和气味更佳。

由图5 可知，发酵时间为5 h 时，发酵乳的感官评分达到最高值为81.33，之后逐渐减小。这是因为发酵时间较短，鸡蛋中仍有少量的具有刺激性气味的三甲胺；而在长时间发酵后鸡蛋液蛋白质溶解度下降[28]，有少数颗粒悬浮被视为杂质，感官评分降低。故选取发酵时间4~6 h 较为适宜。

2.1.3 发酵正交试验

研究发现双蛋白乳制品发酵温度一般高于42 ℃[27]，在温度更高的条件下鸡蛋液发酵后的乳化稳定性增强而感官评价更好[28]，同时考虑到所选菌种中嗜热链球菌占比较大，故固定发酵温度为43 ℃，其他3 个因素进行正交试验，结果见表4、表5。

表4 发酵正交试验设计的结果分析Table 4 Fermentation results of the orthogonal design

表5 正交试验方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal test

由表4 和表5 可知，发酵时间对感官评分影响最大，影响因素主次为C>A>B，即发酵时间>蔗糖添加量>发酵菌接种量，发酵时间影响显著，蔗糖添加量和接种量影响不显著。最优发酵组合为A1B1C2，即蔗糖添加量为7%（质量分数）、发酵菌接种量为10%、发酵时间为5 h。此工艺条件下制备的发酵乳色泽均匀，具有双蛋白发酵乳特有的滋味与气味，酸甜度适中，组织均匀细腻，纯净一致，感官评分为90.54，持水率为43.22%，酸度为83.00 °T，感官评分优于正交试验第5 组。根据正交试验结果，以k 值最优条件重复3 次验证试验，得到感官评分为90.68±0.11，持水率为（43.52±0.43）%，酸度为（83.50±0.50）°T。

2.2 双蛋白发酵乳的调配

按照1.3.5 的方法确定添加剂的用量，试验结果见表6。

表6 调配试验结果与分析Table 6 Blending test results

由表6 可知，添加量为D-异抗坏血酸钠0.10%、β-环糊精0.20%、羧甲基纤维素钠0.10%、卡拉胶0.10%时持水率最优；添加量为D-异抗坏血酸钠0.10%、β-环糊精0.20%、羧甲基纤维素钠0.15%、卡拉胶0.10% 时感官评分最优；添加量为D-异抗坏血酸钠0.10%、β-环糊精0.15%、羧甲基纤维素钠0.20%、卡拉胶0.10% 时酸度最优。以感官评分为最终指标，最优添加组合为D-异抗坏血酸钠0.10%、β - 环糊精0.20%、羧甲基纤维素钠0.15%、卡拉胶0.10%，此时产品酸甜适中，口感优良。最优条件重复3 次做验证试验，感官评分为95.42±0.45，持水率为（57.45±0.06）%，酸度为（83.67±0.57）°T。

2.3 产品品质分析

按最优条件制得最终成品，并对其进行品质分析，结果见表7。

表7 产品品质分析Table 7 Product quality

由表7 可知，加入添加剂后产品感官评分为95.42±0.45，持水率为（57.45±0.06）%，酸度为（83.67±0.57）°T，脂肪含量为（2.66±0.04）g/100 g，非脂乳固体含量为（9.22±0.06）g/100 g，蛋白质含量为（2.60±0.01）g/100 g，多肽含量为（0.45±0.01）mg/g，符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》[29]中对风味发酵乳的规定（脂肪含量≥2.5 g/100 g，蛋白质含量≥2.3 g/100 g，酸度≥70.0 °T）。成品色泽均匀一致，乳黄色，奶味浓郁，酸甜度适中，组织均匀细腻，无乳清析出，无明显异物。

3 结论

采用单因素试验和正交试验研制双蛋白发酵乳。结果表明：鸡蛋酶解液、豆浆、牛奶体积比为1∶3∶1 时效果较好；蔗糖添加量为7%（质量分数）、发酵菌接种量为10%、发酵温度为43 ℃、发酵时间5 h 时制备发酵乳感官评分最佳，为90.68±0.11，持水率为（43.52±0.43）%，酸度为（83.50±0.50）°T，发酵时间对感官评分影响最大。向双蛋白发酵乳中添加D-异抗坏血酸钠0.10%、β-环糊精0.20%、羧甲基纤维素钠0.15%、卡拉胶0.10% 时制得成品，其感官评分最佳为95.42±0.45。

本试验研制双蛋白发酵乳成品色泽均一，颜色为乳黄色，酸度适中，组织均匀细腻，具有发酵乳特有的滋味、气味。产品经过品质分析，其酸度、脂肪含量及蛋白质含量符合GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中对风味发酵乳的规定，是一款新型全蛋双蛋白营养健康食品。