家蚕浓核病病毒和血液型脓病病毒PCR诊断方法的建立及应用

叶 斌，蔡冬冬，李建岗，范 毅，罗 毅，刘伽均，胡晓亮，田志革*

（1.成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；3.宜宾学院农林与食品工程学部，动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室，四川 宜宾 644000）

家蚕血液型脓病也被称作家蚕核型多角体病，是由家蚕血液型脓病病毒（BmNPV）引起的亚急性传染性疾病［1］。该病毒是一种DNA病毒，属于杆状病毒科、核型多角体病毒属、蚕核多角体病毒种，病毒粒子呈长杆状。它是最早被我国科学家发现的一种主要危害家蚕的病原体，早在12世纪的中国农业文献中就已有该病的记载［2］。在家蚕中主要以食下感染和皮肤创伤感染两种方式传播。当病毒进入蚕体后，主要寄生于皮肤上皮及脂肪等组织细胞的细胞核中。一旦家蚕患上血液型脓病后，体色就会变成乳白色，身体发生肿胀等现象［3］。近年来，家蚕血液型脓病成为发病最多、最普遍的传染性蚕病之一，危害程度极高。

家蚕浓核病由家蚕浓核病病毒引起，由于与大蜡螟DNV 相似，将其称为BmDNV［4］。家蚕浓核病病毒（BmDNV）属于细小病毒科、浓核病毒属，无囊膜，病毒粒子呈球形，基因组为4.0～6.5 kb，且为正负链单分子ssDNA，正链和负链包被在不同的衣壳蛋白中［5］。家蚕感染BmDNV后食欲会减退，出现空头症状，将蚕的体壁撕开，可观察到肠内空虚，几乎没有桑叶片，只有黄绿色半透明的消化液［4］。BmDNV具有很强的感染能力，对蚕的毒性非常强，少量病毒，都会引起蚕发病，给养蚕户带来严重的经济损失。

临床上一般通过血清学检测、症状观察和显微镜检查进行粗略地诊断，这些诊断方法存在操作复杂、耗时长、灵敏度低，或者判断不准确的问题。因此，本试验拟建立能够检测单个病原的单重PCR 方法和同时检测两种病原的双重PCR 方法，为BmDNV 和BmNPV的快速检测提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 病毒基因合成 连接有家蚕血液型脓病病毒（BmNPV）ie-1基因和浓核病病毒（BmDNV）ORF2 基因片段的质粒，由北京擎科生物科技有限公司合成，原始浓度为100 ng/μL，于－20 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂Premix Taq DNA聚合酶，DL2000 DNAMarker；琼脂粉，TAE缓冲液（50倍）；EB替代染料等为国产分析纯。

1.3 引物设计 查阅相关参考文献选定BmDNV的ORF2 基因和BmNPV 的ie-1 基因作为病毒检测的基因，在NCBI 官网上分别下载相关基因序列，通过Mega 4.0软件进行同源序列比对，找到其保守区域。根据找到的保守区域位置，在Oligo软件上分别进行BmDNV 和BmNPV的引物设计，并通过Oligo 软件上的Analyze 程序进行检测，确定BmDNVORF2 基因片段扩增的最终引物和BmNPVie-1 基因片段扩增的最终引物（表1）。从Oligo软件中导出设计的最终引物，送往北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 BmDNV和BmNPV基因片段扩增引物信息

1.4 BmDNV、BmNPV 单 重PCR 体 系 的 优化BmDNV、BmNPV单重PCR反应体系为20μL：Premix TaqDNA 聚合酶10μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环；72℃终延伸10 min。在此基础上，对BmDNV、BmNPV 单重PCR 扩增反应的温度条件进行优化。PCR 结束后，取5 μL PCR 扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳鉴定，然后将获得的目的片段胶回收后送往公司测序鉴定。

1.5 BmDNV、BmNPV 单重PCR 方法特异性的检测 使用已经建立的针对BmDNV 的单重PCR方法，分别对BmNPV、BmDNV 的DNA 进行扩增，扩增体系见1.4，同时以ddH2O 为空白对照，检测BmDNV单重PCR反应的特异性。同理，使用建立的BmNPV单重PCR方法，分别对BmNPV、BmDNV 的DNA 进行扩增，扩增体系见1.4，同时以ddH2O 为空白对照，检测BmNPV 单重PCR 反应的特异性。

1.6 BmDNV、BmNPV双重PCR方法的建立 根据建立的两种病毒的单重PCR方法，确定双重PCR方法的反应体系如下：Premix TaqDNA 聚合酶10 μL，BmDNV、BmNPV 上下游引物（10 μmol/L）各1μL，DNA 模板各1μL，ddH2O 补足至20 μL，PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退 火30 s，72 ℃延伸30 s，共30 个循环；最后72 ℃延伸10 min。对反应温度、引物浓度和循环数进行优化，并测定此双重PCR 方法的敏感性。PCR 反应结束后，取5 μL 扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳鉴定。

1.6.1 BmDNV、BmNPV双重PCR 退火温度优化 将BmDNV、BmNPV 双重PCR 反应体系的退火温度分别设为50、52、53.9、58.3、60 ℃五个梯度，再进行PCR扩增。

1.6.2 BmDNV、BmNPV 双重PCR 引物浓度的优化 根据优化的退火温度，将BmDNV 和BmNPV双重PCR 反应体系的上下游引物浓度分别设为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/L 五个梯度，再进行PCR扩增。

1.6.3 BmDNV、BmNPV双重PCR 循环数的优化 采用优化的退火温度和引物浓度，分别设置反应程序为25、30、35个循环，再进行PCR扩增。

2 结果与分析

2.1 BmDNV、BmNPV 单重PCR 扩增条件的优化 以BmDNV的DNA为模板进行单重PCR扩增条件的优化，结果得出：最佳循环数为30个循环，最佳退火温度为50 ℃，最佳引物浓度为0.4 μmol/L。以BmNPV的DNA为模板进行单重PCR扩增条件的优化，结果显示：最佳退火温度为50 ℃，最佳引物浓度为0.5 μmol/L，最佳循环数为30个循环。

2.2 BmDNV、BmNPV 单重PCR 方法的特异性检测 利用建立的BmDNV 单重PCR 方法对BmDNV、BmNPV 的DNA 进行扩增，结果得出此检测方法只对BmDNV有扩增（图1a）。利用建立的BmNPV单重PCR方法对BmDNV、BmNPV进行PCR扩增，结果显示此检测方法只对BmNPV有扩增，对其他体系无扩增（图1b）。

图1 BmDNV和BmNPV单重PCR方法的特异性检测

2.3 BmDNV、BmNPV 双重PCR 扩增条件的优化 以BmDNV 和BmNPV 的DNA 为模板，进行双重PCR 扩增条件的优化，结果显示：最佳循环数为30 个循环（图2a），最佳退火温度为50 ℃（图2b），最佳引物浓度为0.4 μmol/L（图2c）。

图2 BmDNV和BmNPV双重PCR扩增条件的优化

2.4 BmDNV、BmNPV 双重PCR 方法的敏感性检测 利用灭菌ddH2O 对两种病毒DNA 进行10倍梯度稀释，取每个稀释度的1 μL DNA为模板，应用建立的BmDNV、BmNPV双重PCR方法进行敏感性检测。结果表示该方法能同时检测到BmDNV（原始模板浓度100 ng/μL）和BmNPV（原始模板浓度100 ng/μL），最低检测限均为10pg（图3）。

图3 BmDNV和BmNPV双重PCR方法的敏感性检测

3 讨论

中国历来是世界上最大的茧丝生产国和出口国，我国的茧、丝生产量都占世界产量的75%以上［6］，养蚕成为许多家庭的主要收入来源。随着“丝绸之路经济带”和“21 世纪海上丝绸之路”战略构想的提出，蚕丝业必将得到进一步发展［7］。但是养殖家蚕对环境有一定的要求，在密集群体饲养条件下，家蚕极易受病原微生物和其他外界因素的影响而发生各种疾病。

BmDNV 和BmNPV 是家蚕病毒病的重要病原，具有很高的传染性，一旦暴发，就会给养蚕户带来极大的损失。故早期确诊病原对于蚕病的有效防控意义重大。BmDNV 和BmNPV 的单重PCR检测方法，经证实具有较好的敏感性和特异性，基于此本试验建立了两种病毒的双重PCR检测方法，并对其反应体系进行了优化（包括退火温度、循环数、引物浓度），最终确定最佳反应条件。该方法可以更加快速和高效地检测BmDNV和BmNPV 两种病毒，为后续开发组装试剂盒并投入市场奠定了基础。

（责任编辑：曾宪春）