MLMT与MLST在新生隐球菌基因分型中的应用研究*

朱键, 曹佳非, 康颖倩, 三上襄,Wieland Meyer

(1.贵阳市第二人民医院 &贵州医科大学附属金阳医院 消化内科, 贵州 贵阳 550081; 2.贵州医科大学附属医院 消化内科, 贵州 贵阳 550004; 3.贵州医科大学 研究生院, 贵州 贵阳 550004; 4.千葉大学 医学真菌研究中心, 日本 千葉县 260-8673; 5.悉尼大学 Westmead医学研究所, 澳大利亚 悉尼 NSW2145)

隐球菌是一种常见的条件致病性真菌,当机体免疫功能低下时致病,严重时可危及生命。临床上常见的致病性隐球菌分别为新生隐球菌(Cryptococcusneoformans,C.neoformans)和格特隐球菌(Cryptococcusgattii,C.gattii)[1]。C.neoformans广泛存在于世界范围内,感染人群以免疫功能低下的患者为主[2]。分子分型可在分子水平上研究病原微生物的流行病学特征及病原学特点,为病原体的防治及研究提供理论依据。目前,MLST是常用于C.neoformans基因分型的方法[3]。虽然MLST具有高分辨率、可复性及稳定性强、可实现在线数据共享等特点,但其缺点是费用较高、耗时。Hanafy等[4]对15条微卫星序列进行比对,最终挑选出简单重复序列(simple squence repeats,SSRs)具有多态性的3个微卫星位点(CNG1、CNG2 及CNG3)作为C.neoformans菌株MLMT的靶点。本研究分别应用MLMT及MLST对实验菌株进行基因分型鉴定,探讨两种方法在C.neoformans分子分型中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 菌株来源及相关信息

22株菌分别来源于国内5个城市(北京、上海、南京、广州及贵阳)17株;日本2个城市(千葉和长崎)5株菌。22株菌中有16株由HIV患者体内分离出,4株由鸽粪中分离出,2株未知来源,见表1。经Canavanine-glycine-bromothymol blue(CGB)培养基鉴定为C.neoformans。菌株接种于马铃薯培养基琼脂培养基,在30 ℃条件下培养48～72 h备用。

表1 MLMT及MLST各位点引物及扩增条件列表Tab.1 List of primer and PCR amplification condition of locus for MLMT and MLST

1.2 研究方法

1.2.1DNA提取、相应位点序列PCR扩增及测序 按文献[4]所述,进行22株菌DNA提取,应用MLMT的CNG1、CNG2及CNG3微卫星灶相应引物进行PCR扩增,扩增后产物进行测序;参照共识意见及文献[3,5],采用MLST的7个位点(CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1及URA5)的特异性引物进行相应的序列PCR扩增,扩增后产物进行测序。各位点引物及PCR扩增条件见表1。

1.2.2MLMT分析 按文献[4]所述计算各菌株3个微卫星灶的不同SSRs(CNG1-TA、CNG2-GA及CNG3-CAT)重复数以确定各微卫星灶的等位基因型,等位基因型用编号来代表,整合各菌株3个微卫星灶的等位基因型即可获得菌株的MLMT基因型,基因型用数字编号代表。

1.2.3MLST分析 采用Genetyx.ver.11和ATCG.ver.7对22株菌所测定的MLST的7个位点等位基因序列进行处理,处理后序列上传至网站(https//mlst.mycologylab.org),获取各菌株每个位点的相应等位基因型及序列型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件包进行统计学分析,Fisher精准检验对两种方法分型能力进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLMT基因分型及分布

经MLMT将22株菌分为7个基因型,分别为MLMT2、14、16、17、29、34及39;在16株临床菌株中,13株菌基因型为MLMT17;基因型MLMT14、34及39各1株;4株环境菌株中,3株菌的基因型为MLMT17,而其余1株菌的基因型MLMT29,见表2。3个微卫星位点中CNG1的等位基因型为1～5;CNG2的等位基因型为3、4、5;CNG3的等位基因型为1、2及6,见表3。在7个MLMT基因型中,MLMT17最常见(16/22, 72.73% ),该基因型菌株普遍分布于两个国家各城市,在环境及患者中均可分离出该基因型菌株;其CNG1、CNG2及CNG3等位基因型为3、5、2, 各微卫星灶的SSRs的重复数分别为12个TA和GA,7个CAT。见图1。

图1 MLMT17的微卫星灶(CNG1、CNG2及CNG3)简单重复序列Fig.1 Tandem sequence repeatsof micro-satellite(CNG1,CNG2,and CNG3)for MLMT17

表2 新生隐球菌菌株基本信息、MLMT、MLST及整合后基因型Tab.2 Basic information,MLMT,MLST and genotypes list of C. neoforman

表3 不同基因型MLST及MLMT等位基因型结果Tab.3 Allele type results of MLMT and MLST in different genotypes

2.2 MLST基因分型及分布情况

MLST将22株菌分为4个基因型,分别为MLST5、31、32及66,最常见基因型为MLST5(19/22, 86.36%),可见于两个国家各城市,在环境及患者菌株中均可分离出该基因型,见表2。MLST的7个位点中CAP59等位基因型为1和7,GPD1为1和3,IGS1为1和10,LAC1为3、5及12,PLB1为1、2及4,SOD1为1,URA5为1和2。MLST5的7个位点的等位基因谱为1-3-1-5-2-1-1。见表3。

2.3 MLMT与MLST整合基因型

综合MLST及MLMT结果将22株菌鉴定为7个MLMT/MLST基因型,分别为2/66,14/32,16/5, 17/5,34/5,39/5及29/31。中国菌株中有6个基因型(14/32,16/5,17/5,34/5,39/5及29/31),日本菌株有2个(2/66和17/5)。MLMT17/MLST5为两国菌株共有基因型,在所有基因型中所含菌株数最多(16/22,72.73%) 。见图2。

图2 22株新生隐球菌基因型分布Fig.2 Genotype distribution of 22 C.neoformans Strains

2.4 菌株MLMT与MLST基因型对比

MLMT17菌株经MLST方法确定为MLST5外,MLMT16、34、39菌株也被鉴定为MLST5。MLMT2、14及29分别对应MLST66、32及31,见表3。通过统计学软件比较两种方法在基因分型中分辨能力差异,结果显示两种方法在C.neoformans菌株基因分型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

MLST技术是通过对保守基因的基因序列进行分析揭示等位基因突变,从而对病原体达到分型鉴定的目的。MLMT是建立在微卫星DNA简单重复序列的多态性基础上,对病原体进行分型鉴定。两种方法在C.neoformans分型鉴定中均具有高分辨力,可复性及稳定性强的优点[4,6]。MLST研究表明C.neoformans菌株基因型具有地区特异性。例如：东亚地区主要的基因型为MLST5[7-9];MLST4及6在泰国常见;在印尼、印度、拉丁美洲及民主刚果共和国MLST93常见[10-13];而在欧洲和地中海地区MLST23是这些地区的优势基因型[14]。这种差异不仅表现在地区之间,而且环境和临床菌株之间也存在一定的差异。通过MLST对C.neoformans的国内临床菌株进行分型,提示MLST5是主要的基因型[15-16],而对C.neoformans分型也发现环境和临床菌株的主要基因型也存在明显不同[19]。不但如此,不同基因型的C.neoformans菌株毒力也不同[20]。研究表明MLST5是毒力强的基因型,有较高的致残及致死率[21-22]。本研究中MLST5菌株占比最高(19/22,86.36%),与有关报道相一致[7]。通过MLMT方法对MLST5菌株进行基因分型中发现MLMT17所占比例最大(16/19,84.2%),进一步提示MLMT17/MLST5是国内及日本C.neoformans菌株中最常见的基因型。与 MLMT17/MLST5相比,MLMT16/MLST5及MLMT39/MLST5菌株仅在1个微卫星灶有差别,考虑这两个基因型与MLMT17/MLST5有亲缘关系。与有关报道[17-18]不符的是,在环境菌株基因型中,MLST5为本次研究中最常见基因型,考虑可能与本次研究纳入环境样本量少有关,需加大样本量进一步研究分析。

Meyer等[3]通过辛普森指数对MLST应用于C.neoformans基因多样性研究进行统计分析发现,至少需要7个保守基因/管家基因才可满足新生隐球菌菌株基因分型鉴定的需求。Hanafy等[4]应用3个微卫星灶(CNG1、CNG2及CNG3)的简单重复序列进行新生隐球菌基因分型鉴定,分辨能力达D=0.992。本研究应用两种方法对22株C.neoformans进行分型鉴定,通过MLMT产生7个基因型,而MLST产生4个基因型。虽然MLMT产生基因型多于MLST,但是统计学分析两种分型方法无明显差异,提示MLMT与MLST方法效果相当。相比MLST,包含有CNG1、CNG2及CNG3微卫星灶的MLMT方法具有省时,高效,费用低,并且操作简单的优点。本研究在MLST结果分析中发现MLMT34也属MLST5,而该基因型与MLMT17的3个微卫星灶均存在简单重复序列重复数的差异,提示MLMT方法可作为MLST分型方法的补充。MLMT17/MLST5与MLMT39/ST5之间在表型、毒力、耐药等方面有无差异有待进一步研究及探讨。

综上所述,本研究通过MLMT及MLST方法对C.neoformans菌株进行基因分型显示MLMT17/MLST5是我国及日本C.neoformans中常见的基因型。MLST和MLMT两种方法所获得的结果高度一致。与MLST方法相比,包含CNG1、CNG2及CNG3微卫星灶的MLMT方法可作为MLST替代或补充,便于在C.neoformans菌株分子流行病学及遗传背景研究中推广使用。