骨痹通消颗粒对激素型股骨头坏死人骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化的影响

王壮壮 周正新 朱 磊 朱彩玉 顾一帆 李子鹏 陈少奇李 胜

1.安徽中医药大学第一临床医学院，安徽合肥 230031；2.安徽中医药大学第一附属医院骨伤二科，安徽合肥 230031

股骨头坏死是由各种原因导致股骨头血运受阻及骨细胞数量减少的一种骨关节疾病[1]。糖皮质激素（glucocorticoid，GC）在近些年应用广泛，导致激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）患者日益增多[2]。医学界各大学者从未停止过对此病的深入研究，但仍有很多病理学及病因在临床尚未得到充分验证[3]。人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMMSC）是一种能够分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞的成体干细胞[4]。研究表明，使用过量激素可能会造成hBMMSC 成骨/成脂分化功能紊乱，使骨组织的修复再造受阻[5]。而SANFH 的发病与hBMMSC分化异常密切相关。因此，调控hBMMSC分化对于治疗SANFH 至关重要。中药骨痹通消颗粒是由安徽中医药大学第一附属医院著名骨科专家丁锷教授的经验方化裁而来，前期基础研究表明，该方能够抑制糖皮质激素对骨细胞与成骨细胞的破坏[6-7]。为此，本研究通过提取hBMMSC进行实验分析，探讨骨痹通消颗粒对hBMMSC成骨和成脂分化的影响，进一步为骨痹通消颗粒治疗SANFH 奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞 30 只清洁级新西兰白兔，体重3.0～3.5 kg，采购于安徽省动物实验中心[许可证号SCXK（皖）2020-001，合格证号：NO.202213656]，严格遵守动物伦理学进行饲养（AHUCM-rabbits-2022023）。骨髓取自2021 年9 月至2022 年9 月安徽中医药大学第一附属医院10 例骨伤科SANFH 并行手术患者，用于体外培养hBMMSC。患者平均年龄（52.83±8.55）岁。本研究方案已获得安徽中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准（2022AH-81）。

1.1.2 实验药物 骨痹通消颗粒（赤芍12 g、丹参15 g、续断10 g、川芎10 g、淫羊藿10 g、当归10 g、甘草6 g、土鳖虫6 g、肉桂4 g）是安徽中医药大学第一附属医院院内制剂，由该院中药房制作、采购，注射用地塞米松磷酸钠（5 mg/支，马鞍山丰原制药有限公司）。

1.1.3 主要试剂和仪器 茜素红染色液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0140）；油红O 染液（北京索莱宝科技有限公司，批号：G1262）；成骨与成脂诱导分化试剂盒（加拿大STEMCELL 公司，批号：2320036、2320056）；CCK-8 试剂盒（上海奕杉生物科技有限公司，批号：100-106）；RNA 提取试剂盒（广州美基生物，批号：RJH19-01）；反转录试剂盒[新贝（上海）生物科技有限公司，批号：R202-02]；BMP-2、Runx2、βcatenin、PPARγ、C/EBP-α 及Fabp4 抗体均购自Bioss公司（批号：AB11286487、AB09245415、AB10163878、AB178860、AB40764、AB32552）；二抗羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BST16D22C16C54）。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备 20 只大白兔适应性饲养1 周后，按照人与兔的体重计算等效剂量[8]，给予骨痹通消颗粒（4.5 g/kg）灌胃，每天2 次，灌胃7 d 后，腹腔注射3%戊巴比妥钠（45 mg/kg）进行麻醉，进而心脏采血并无菌分离含药血清，分装后贮存在-20 ℃冰箱备用。动物尸体由安徽中医药大学实验动物中心统一处理。

1.2.2 hBMMSC 分离、培养及鉴定 在患者行全髋关节置换术时，用5 ml 注射器从股骨中抽取1～2 ml 骨髓液，加入完培培养基培养，每隔2 d 换液1 次，当细胞密度达到80%～90%时，消化并传代细胞继续培养。取第三代细胞在显微镜下观察细胞形态学，并分别进行成骨和成脂诱导培养。每隔3 d 换液1 次，21 d 后进行茜素红染色、油红O 染色，显微镜下观察胞髓系分化潜能。

1.2.3 CCK-8 检测细胞增殖 将第三代细胞以1×104/孔均匀铺在96 孔板上，并分为完培组（基础培养基+10%的胎牛血清）及1%、2%、5%、8%、10%体积分数的含药血清A 组，每组10 个复孔，培养24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液10 μl，孵育1 h，在酶标仪上以450 nm 的波长检测各组的光密度（optical density，OD）值。为了进一步探究骨痹通消颗粒对GCs 环境下hBMMSC 细胞活力的影响，继续种细胞于96 孔板，细胞贴壁后，每孔加入0.52 μl 地塞米松溶液，分为损伤组（基础培养基+10%的胎牛血清+0.52 μl 地塞米松溶液）与含药血清B 组（分别为基础培养基+2%、5%、8%含药血清+0.52 μl 地塞米松溶液），同时制备完培组（基础培养基+10%的胎牛血清）。每组10 个复孔。培养24 h 后，按照CCK-8 试剂盒测定各孔波长450 nm 处的OD 值。

1.2.4 实验分组 基于“1.2.3”的实验结果重新分组为对照组、模型组、实验组。无激素诱导细胞作为对照组（基础培养基+10%的胎牛血清）。参考文献[9]中方法，使用地塞米松（10-5mol/L）溶液诱导细胞损伤，随后将体外激素诱导的hBMMSC 细胞分为模型组（基础培养基+10%的胎牛血清+10-5mol/L 地塞米松溶液）、实验组（基础培养基+5%的骨痹通消含药血清+10-5mol/L地塞米松溶液）。

1.2.5 hBMMSC 成骨分化 调整细胞密度为5×104/ml，铺在6 孔板上，按“1.2.4”项下分组，每组3 个复孔。分别给予各组含相应血清的hBMMSC 成骨诱导分化培养基培养，每隔3 d 更换1 次培养基。21 d 后按照成骨染色试剂盒染色后在显微镜下观察。

1.2.6 hBMMSC 成脂分化 调整细胞密度为5×104/ml，铺于6 孔板，按“1.2.4”项下分组，每组3 个复孔。分别给予各组含相应血清的hBMMSC 成脂诱导分化培养基培养，每隔3 d 更换1 次培养基。21 d 后按照成脂染色试剂盒染色后在显微镜下观察。

1.2.7 RT-qPCR 检测hBMMSC 中成脂相关基因的表达 选取PPARγ、C/EBP-α 及Fabp4 作为目标检测基因，β-actin 为内参。按照试剂盒说明书提取细胞中RNA，并检测其纯度。取2 μg 的RNA，按照37 ℃、15 min，85 ℃、5 s 反应程序将RNA 反转录为cDNA，于-20℃冰箱保存，加入相应引物和荧光染料扩增，反应体系为50 μl，其中10×PCR Buffer 5 μl,d NTPs 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA 模板2 μl，Tap 酶0.5 μl，加双蒸水至50 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，循环45 次，72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法进行数据分析。引物序列见表1。实验重复3 次。

表1 各基因引物序列（5’-3’）

1.2.8 Western blot 检测hBMMSC 中成骨相关蛋白的表达 选取BMP-2、Runx2 及β-catenin 为目标蛋白，β-actin 为内参。使用RIPA 和PMSF 混合而成的裂解液提取各组蛋白，BCA 法测定浓度。依次进行上样、凝胶电泳、转膜及封闭，在4 ℃环境下配摇床孵育一抗（1∶1 000）过夜。TBST 洗膜3 次，室温孵育对应的二抗（1∶5 000），采用Image J 软件分析条带。并计算目标蛋白相对表达量。实验重复3 次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验；计数资料采用例数或百分率表示，比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hBMMSC 的形态学及髓系分化潜能鉴定

将抽提的骨髓接种后，显微镜下观察显示，原代细胞呈圆形或其他不规则形状，7 d 后，可见梭形、纺锤形或多角形的贴壁细胞（图1A）。第三代细胞生长均匀，平行排列，透光率好（图1B）。成骨诱导21 d，细胞发生改变，局部细胞聚集，并有矿化结节产生，茜素红染色呈阳性（图1C）；成脂诱导21 d，脂滴与油红O染液结合变为红色，油红O 染色呈阳性（图1D）。

图1 细胞形态学观察及髓系分化（40×）

2.2 骨痹通消颗粒降低GCs 对hBMMSC 细胞活力的影响

与完培组比较，10%体积分数的含药血清A 组细胞活力下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。与完培组比较，损伤组细胞活力下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与损伤组比较，2%、5%、8%体积分数的含药血清B 组可细胞活力升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。5%体积分数的含药血清B 组细胞活力高于2%、8%体积分数的含药血清B 组。见图2～3。

图2 不同体积分数的骨痹通消含药血清作用24 h 后对细胞增殖的影响（n=10）

图3 不同体积分数的骨痹通消含药血清对激素环境中细胞活力的影响（n=10）

2.3 各组成骨分化情况

与对照组比较，模型组染色面积降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，实验组中矿化结节与沉积升高，染色范围也更广，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4、表2。

图4 各组茜素红染色情况（40×）

表2 各组细胞钙化结节数（±s）

表2 各组细胞钙化结节数（±s）

注与对照组比较，aaP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05。

2.4 各组成脂分化情况

与对照组比较，模型组细胞内脂质积累增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，实验组较细胞内脂质积累降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5、表3。

图5 各组油红O 染色情况（40×）

表3 各组细胞脂滴数（±s）

表3 各组细胞脂滴数（±s）

注与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

2.5 各组成脂相关基因表达

与对照组比较，模型组PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4的表达量升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01），与模型组比较，实验组PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4 的表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

图6 各组细胞基因表达情况（n=3）

2.6 各组成骨相关蛋白表达。

与对照组比较，模型组BMP-2、Runx2 及β-catenin蛋白表达含量升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，实验组BMP-2、Runx2 及β-catenin 蛋白表达含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图7～8。

图7 各组成骨蛋白条带图

图8 各组蛋白的相对表达量（n=3）

3 讨论

SANFH 的发病机制有很多，如成骨成脂分化失衡、脂肪栓塞、骨质疏松、细胞凋亡与功能失衡，以及凝血异常等[10-12]。hBMMSC 成骨成脂分化的失衡是最主要的发病机制之一。当脂肪细胞增多，容易引起凝血障碍，导致细胞凋亡与功能失衡，继而导致股骨头骨髓坏死的恶性循环[13]。该病在中医上为“骨蚀”范畴。《素问·痹论》篇曰：“风、寒、湿三气杂至合，病在骨，骨髓酸痛，而为骨蚀。”发病根本在于肾虚，与脾肾密切相关，脾肾两虚导致痰结血瘀，不通则痛，不荣则痛，而疼痛是SANFH 最明显的临床特征[14-15]。大量研究数据表明，补肾壮阳、活血化瘀类方药对激素性股骨头坏死具有一定的治疗效果[16-18]。骨痹通消颗粒选用有强筋健骨之功的淫羊藿、续断、土鳖虫与活血化瘀止痛作用的丹参、赤芍、川芎、当归及引火归元的肉桂，加以甘草调和诸药，共奏补肾活血化瘀之功[19]。hBMMSC 在疾病的发展过程中至关重要，成骨-成脂分化在生理状态下处于动态平衡状态，若长期使用大量糖皮质激素会打破这种平衡，导致二者分化出现异常，进而引起SANFH 等相关疾病[20-21]。因此，对于改善成骨-成脂的分化比例，延缓SANFH 的进程有重大意义。本研究于体外分离hBMMSC，加以骨痹通消颗粒含药血清培养，观察其对hBMMSC 增殖及成骨、成脂分化的影响，明确骨痹通消颗粒发挥作用的机制。

茜素红染色能够反映成骨分化晚期钙化结节的数量。本研究表明，骨痹通消颗粒含药血清能够促进hBMMSC 钙化并减少细胞中脂质生成，抑制其成脂分化的能力。hBMMSC 的分化由许多转录因子调控。Runx2 是一种hBMMSC 向成骨细胞分化的不可或缺的转录因子，且可抑制hBMMSC 成脂分化[22]。BMP-2能够促进hBMMSC 分化为成骨细胞[23]。β-catenin 作为Wnt/β-catenin 的通路蛋白，能够激活该通路来促进hBMMSC 向成骨分化。PPARγ 对Runx2 有负向调节作用。在hBMMSC 成骨与成脂分化时，Runx2 和PPARγ 共同调控各种细胞因子以维持平衡，GCs 能够通过下调Runx2 的表达抑制hBMMSC 的成骨分化作用，通过上调PPARγ 的表达促进其向成脂分化[24]。C/EBP-α 与Fabp4 同样为hBMMSC 在脂肪分化过程中的关键基因，能够与PPARγ 共同调控成脂相关蛋白[25]。本研究发现，骨痹通消颗粒能够促进hBMMSC 中成骨相关蛋白BMP-2、Runx2 及β-catenin的表达，且可下调成脂相关基因PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4 中mRNA 的表达，进一步证明骨痹通消颗粒含药血清促进成骨分化、抑制成脂分化的药效作用。

综上所述，骨痹通消颗粒能够促进hBMMSC 成骨分化的能力，并抑制其向成脂分化，进一步调控hBMMSC 成骨-成脂分化的平衡与稳态，起到防治激素性股骨头坏死的作用。为了更好地发挥骨痹通消颗粒的功效，还需更多临床及动物实验进一步探究其对SANFH 的防治优势。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。