长链非编码RNA PTENP1 通过miR-3611/ PTEN 基因途径调控宫颈癌进程的分子机制研究

包利利 赵 达 俞 岩 周俏苗▲

1.海南医学院第一临床学院，海南海口 570216；2.海南省妇女儿童医学中心妇科，海南海口 570100

宫颈癌是女性癌症中第四大常见的癌症[1-2]。尽管手术及放化疗方法在过去几十年里逐渐被应用于宫颈癌的治疗，但其5 年预后情况仍较差[3]。因此，深入开展宫颈癌机制探讨对改善宫颈癌患者的预后及新疗法的开发具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）具有染色质修饰、转录、剪接和表观遗传调控等多种生物学功能[4-7]。多项研究表明，lncRNA 可以调节DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑，并作为微RNA（microRNA，miRNA）的前体调控肿瘤的发生[8-9]。近期研究表明，lncRNA 通过内源性竞争RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制调控miRNA 对靶基因的抑制作用，参与癌症调控过程[10]。lncRNA PTENP1（以下简称“PTENP1”）是肿瘤抑制因子PTEN 基因的“假基因”，在许多恶性肿瘤中通过调节PTEN 基因的表达发挥其抑制肿瘤的功能，但其在宫颈癌中的作用尚不清楚[11-14]。因此本研究旨在探讨PTENP1 在宫颈癌进程中的作用及其机制，为宫颈癌的早期筛查及靶向治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究选取54 例2019 年1 月至2022 年12 月在海南省妇女儿童医学中心确诊的宫颈癌患者，收集其癌组织和癌旁组织（与肿瘤组织距离≥5 cm）。患者年龄（45.34±12.73）岁，肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期27 例，Ⅲ～Ⅳ期27 例。纳入标准：①经病理诊断为宫颈癌；②资料完整。排除标准：①远处转移；②合并其他恶性肿瘤；③妊娠期或哺乳期；④手术前经过放化疗处理。本研究经过海南省妇女儿童医学中心医学伦理学委员会批准（HNWCMC 伦审2022 年第[136]号）。

1.2 细胞系选择与培养

宫颈癌细胞系（HeLa、SiHa、C33A、Caski）、正常宫颈上皮细胞H8 及293T 细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院。所有细胞置于含有10% FBS 的DMEM 培养基（美国Gibco 公司）中，于37 ℃和5%的CO2条件下培养。

1.3 细胞分组和相应的处理

选取合适的宫颈癌细胞系进行下一步实验，将处于对数生长期的细胞分为以下七组：空白组（无处理）、pcDNA3.1 组（转染pcDNA3.1）、pcDNA3.1-PTENP1组（转染pcDNA3.1-PTENP1）、NC 组（阴性对照，转染模拟物或抑制剂NC）、miR-3611 抑制剂组（转染miR-3611 抑制剂）、pcDNA3.1-PTENP1+NC 组（转染pcDNA3.1-PTENP1 和NC）、pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 组（转染pcDNA3.1-PTENP1 和miR-3611模拟物）。其中pcDNA3.1、pcDNA3.1-PTENP1、抑制剂NC、miR-3611 抑制物、NC、miR-3611 模拟物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。细胞转染采用Lipofectamine 2000（美国Invitrogen，748253）进行，所有细胞实验均设置独立的3 个复孔。

1.4 PTENP1 在细胞中的亚定位检测

将宫颈癌细胞用PBS 清洗并置于冰上，用500 ml预冷的细胞分馏缓冲液重新悬浮细胞，在冰上溶解10 min。细胞离心5 min（转速为5 000 r/min，半径为165 mm），将上清液（细胞质）与沉淀（细胞核）分离，然后进行PTENP1 相对表达量的检测。

1.5 实时荧光定量PCR 检测

使用Trizol（美国Invitrogen，1422）试剂提取组织和细胞的总RNA，用AMV 反转录酶处理1 μg RNA以获得cDNA。PCR 引物序列见表1。GAPDH 作为mRNA 相对定量的内参基因，U6 用于细胞核内RNA和miRNA 的内参基因。PCR 扩增的条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min 的40 个循环。反应体系为20.0 μl，包括TB Green Premix Ex Taq 10.0 μl，正、反向引物分别0.4 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl，DNA模板2.0 μl，灭菌水6.8 μl。最后采用2-ΔΔCt方法分析数据。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.6 CCK-8 检测

将处理后的宫颈癌细胞悬液稀释后接种于96 孔板，1×103个/孔。分别于培养0、24、48、72、96 h 的孔中加入10 μl 的CCK-8（美国Sigma），然后培养4 h，用酶标仪（美国Bio-Rad，6532）在450 nm 波长下测量光密度（optical density，OD），每个时间点设置独立的3 个复孔。

1.7 流式细胞仪检测

将体积为200 μl 的细胞沉淀重悬在100 μl 的结合缓冲液中，加入2 μl 的Annexin-V-FITC（20 μg/ml），并在冰上混合。15 min 后加入300 μl 的PBS。每个样品在30 min 内加入1 μl PI 后进行上机检测，每组设置独立的3 个复孔。

1.8 蛋白质免疫印迹法检测

使用BCA 试剂盒（武汉博斯特生物技术有限公司，33528）提取并测定各组细胞和组织的蛋白质。分解后的蛋白质被转移到PVDF 膜上。在室温下用5%BSA 进行封闭。PTEN 蛋白（1∶1 000，ab43756）、上皮钙黏素（1∶1 000，ab7486）、波形蛋白（1∶1 000，ab13457）和β-actin（1∶3 000，ab2378）的一抗购买自美国Abcam。加入一抗并在4℃下孵育过夜后，5 min 内用TBST 洗膜3 次，加入相应的二抗[迈特（上海）生物科技有限公司，178263]，在室温下孵育1 h。使用Bio-Rad成像仪（美国Bio-Rad）来获得图像。目标条带的灰度值由Image J 软件进行分析。每个测试重复3次。

1.9 免疫荧光染色

采用4%多聚甲醛在室温下固定30 min 后在室温下加入0.1%Triton X-100。约10 min 后，加入正常山羊血清后加入上皮钙黏素和波形蛋白的抗体，在37℃的摇床下孵育2 h 后用PBST 清洗3 次，采用显微镜进行观察拍照。

1.10 双萤光素酶报告实验

使用生物信息学软件（http://www.targetscan.org）来预测PTENP1 和miR-3611 的关系。合成的PTENP1 3’UTR 基因序列通过限制性酶位点Bamh1 和Ecor1将PTENP1 3’UTR 基因序列引入到pMIR-reporter。将确认的野生型和突变型质粒分别与模拟物NC 和miR-3611 模拟物转染到293 T 细胞。使用生物信息学软件（http://www.targetscan.org）预测miR-3611 和PTEN 基因3’UTR 的结合部位。构建PTEN 基因3’UTR 野生型质粒，合成PTEN 基因3’UTR 启动子序列与miR-3611 的结合位点，构建了PTEN 基因3’UTR 突变体质粒。然后将PTEN 基因3’UTR 野生型和PTEN 基因3’UTR 突变型质粒转染给模拟物NC和miR-3611 模拟物转入293T 细胞，使用Lipofectamine 2000 调节剂转染48 h 后使用萤光素酶试剂盒（美国BioVision，BC1573）来检测萤光素酶的活性。

1.11 RNA 下拉实验

将总体积为50 nmol/ml 的miR-3611 转染生物素标记的野生型和50 nmol/ml 的miR-3611 转染生物素标记的突变型分别转染到细胞。转染48 h 后，收获细胞并用PBS 清洗，然后用细胞裂解缓冲液（美国Ambion，2375）孵育10 min。然后制备50 ml 的细胞裂解液，用M-280 链霉菌素预涂的无核糖核酸酶在4℃下孵育3 h 后应用实时荧光定量PCR 检测PTENP1 的表达。

1.12 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织与癌旁组织、各个宫颈癌细胞系及不同处理组中PTENP1 的表达量比较

癌组织中PTENP1 相对表达量低于癌旁组织，HeLa、SiHa、C33A、Caski 细胞PTENP1 相对表达量低于H8 细胞（P＜0.05）。选择宫颈癌细胞系中PTENP1相对表达量最低的Caski 细胞和最高的HeLa 细胞进行后续实验，PTENP1 在Caski、HeLa 细胞质中高表达。Caski、HeLa 细胞的pcDNA3.1-PTENP1 组PTENP1 相对表达量均高于空白组（P＜0.05）。见图1。

图1 癌组织与癌旁组织及各个宫颈癌细胞系中PTENP1 的表达比较（n=3）

2.2 空白组、pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-PTENP1 组细胞增殖活力及凋亡率比较

Caski、HeLa 细胞的pcDNA3.1-PTENP1 组增殖活力（培养48、72、96 h）低于空白组，凋亡率高于空白组（P＜0.05）。见图2。

图2 空白组、pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-PTENP1 组细胞增殖活力及凋亡率比较（n=3）

2.3 空白组、pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-PTENP1 组上皮间质转化相关指标比较

Caski、HeLa 细胞的pcDNA3.1-PTENP1 组ZEB1、Snail mRNA 相对表达量低于空白组，上皮钙黏素、波形蛋白水平高于空白组（P＜0.05）。见图3。

图3 空白组、pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-PTENP1 组上皮间质转化相关指标比较（n=3）

2.4 癌组织与癌旁组织、各个宫颈癌细胞系及不同处理组中miR-3611 的表达比较

癌组织miR-3611 相对表达量高于癌旁组织，HeLa、SiHa、C33A、Caski 细胞miR-3611 相对表达量高于H8 细胞（P＜0.05）。Caski、HeLa 细胞miR-3611 抑制剂组miR-3611 相对表达量低于空白组（P＜0.05）。见图4。

图4 癌组织与癌旁组织及各个宫颈癌细胞系中miR-3611 的表达情况（n=3）

2.5 pcDNA3.1-PTENP1+NC 组、pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 组不同时间点细胞增殖活力及上皮间质转化相关指标比较

Caski、HeLa 细胞pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 组细胞增殖活力（培养48、72、96 h）、上皮钙黏素低于pcDNA3.1-PTENP1+NC 组，ZEB1、Snail mRNA相对表达量及波性蛋白水平高于pcDNA3.1-PTENP1+NC 组（P＜0.05）。见图5。

图5 pcDNA3.1-PTENP1+NC 组、pcDNA3.1-PTENP1+miR-3611 mimics 组不同时间点细胞增殖活力及上皮间质转化相关指标比较（n=3）

2.6 癌组织与癌旁组织、各个宫颈癌细胞系及不同处理组中PTEN 基因及其蛋白的表达比较

癌组织中PTEN 基因及其蛋白低于癌旁组织，HeLa、SiHa、C33A、Caski 细胞PTEN 基因及其蛋白低于H8 细胞（P＜0.05）。Caski、HeLa 细胞的pcDNA3.1-PTENP1组PTEN 基因高于空白组，miR-3611 抑制剂组PTEN 基因高于空白组（P＜0.05）。见图6。

图6 癌组织与癌旁组织、各个宫颈癌细胞系及不同处理组的PTEN 基因及其蛋白的表达比较（n=3）

2.7 PTENP1 与miR-3611 及PTEN 的靶向关系验证

Caski、HeLa 细胞pcDNA3.1-PTENP1 组miR-3611相对表达量高于空白组，miR-3611 抑制剂组PTENP1相对表达量高于空白组（P＜0.05）。野生型miR-3611转染生物素标记的Caski、HeLa 细胞的PTENP1 相对表达量高于转染生物素标记的空白细胞和突变型miR-3611 转染生物素标记的细胞，分别转染PTENP1或PTEN 基因野生型和miR-3611 模拟物的293T 细胞的相对萤光活性低于仅转染PTENP1 或PTEN 基因野生型的293T 细胞（P＜0.05）。见图7。

图7 PTENP1 与miR-3611 及PTEN 的靶向关系验证（n=3）

3 讨论

目前研究表明，ceRNA 调控网络参与了各种生物活动，如调节癌症发生和发展的基因表达[15]。本研究显示，PTENP1 通过靶向miR-3611 来上调PTEN 基因，以抑制宫颈癌中的细胞增殖并促进上皮间质转化。miR-3611 是位于人类染色体7 上的DNA 复制基因MCM7 的第13 个内含子[16]。既往研究显示，miR-3611在肿瘤发生中的作用与PTEN 基因肿瘤通路和TGF-β 信号通路相关[17-19]。本研究中的双萤光素酶报告基因测定验证了miR-3611 与PTEN 基因的靶向关系，进一步RNA 下拉实验结果也提示PTENP1 和miR-3611 之间的结合关系。

PTEN 基因是PI3K-Akt 信号通路的重要负调节因子，支持PTEN 基因和PTENP1 在调节肿瘤进展中细胞凋亡。此外，上皮间质转化被认为是肿瘤细胞侵袭和转移的最重要机制之一，其中上皮细胞具有间充质和成纤维细胞样特性[20-24]。先前研究表明，PTEN 基因缺失或PI3K/Akt 信号通路激活可促进前列腺癌细胞的上皮间质转化和肿瘤进展，本研究与这一观察结果一致[25]。尽管本研究已经在细胞实验对这一结论进行探究，但目前仍然缺少必要的动物及深入的临床数据对这一分子机制进行验证。因此这也是未来的主要研究方向。

综上所述，本研究阐明了PTENP1 与miR-3611竞争性结合以调节PTEN 基因表达影响宫颈癌进程，以上结果为宫颈癌的靶向治疗及早期诊断提供了理论支持。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。