蓝莓原浆抗氧化及缓解视疲劳功能研究

蔡轶男，王乐兵，李德海，2*

（1 东北林业大学生命科学学院 哈尔滨150040 2 黑龙江省森林食品资源利用重点实验室 哈尔滨 150040）

蓝莓属于杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）植物，别名越橘，多年生落叶或者常绿灌木。蓝莓果为扁圆形，成熟果实为深蓝色[1]。蓝莓含有丰富的营养物质，其中花青素含量很高，具有极高的营养价值。花青素属于多酚类物质，是一类植物中普遍含有的水溶性色素，通常经糖基化修饰后形成花色苷[2]。研究表明，蓝莓花青素不仅可以提供鲜艳的色彩，还具有具有显著的抗氧化[3-5]，改善视力，清除人体自由基、抑制肿瘤细胞增生[6]，神经保护[7]，防止细胞衰老，降血糖血脂，预防心血管疾病[8]等功效。

近年来随着社会中各种智能电子产品的广泛使用，眼部视力问题越来越凸显，近视已成为世界范围内关注的公共健康问题[9]。花青素对视力的保护作用逐渐得到人们的重视，现有国内外研究学者通过体内模型（即人体干预和动物实验）和体外模型（细胞培养）研究有关花青素对视力的保护作用。有科学家报道蓝莓中的成分，如花青素、多酚和紫檀芪可以通过抗氧化作用、抗血管生成和抗衰老作用保护视网膜色素上皮细胞免受光致视网膜损伤[10-11]，蓝莓提取物（BAE）可以通过抗氧化和抗炎机制对人视网膜血管内皮细胞起到保护作用，可作为开发糖尿病相关视网膜病变的药物的理想成分[12]。还有研究表明花青素能抑制短暂性近视，减少眼睛疲劳或增强青光眼患者的视网膜血流量[1-14]。然而，蓝莓花青素能够起到缓解视疲劳的作用是否与其抗氧化性有密切关系尚不清楚。

本研究采用小鼠体内抗氧化和人体试饮试验探究蓝莓花青素抗氧化性与缓解视疲劳的相关性。采用低、中、高蓝莓原浆剂量对小鼠进行连续灌胃30 d，测定昆明种（KM）小鼠体内蛋白、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性。同时招募具有视疲劳症状的志愿者进行蓝莓原浆试饮试验，监测其明视持久度、视疲劳症状积分等，旨在为进一步开发蓝莓花青素功能性食品提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓原浆，由野生蓝莓经过打浆制作而成，其原花青素含量为11.6 g/L，野生蓝莓由森骄山特产品责任有限公司提供；18～20 g 清洁级健康昆明种（KM）雌性小鼠，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，生产和使用许可证号：NO.SCXK（辽）2020-0001，饲养温度20～22 ℃，相对湿度50%～60%，自由饮水、进食。

试饮人群为东北林业大学在校本科备考学生，每日学习时间超过8 h，经测试视疲劳症状明显。

生理盐水（0.9%），哈尔滨三联药业股份有限公司；维生素C（食品级），石药集团维生药业（石家庄）有限公司；总蛋白（Total protein，TP）试剂盒、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）试剂盒、过氧化氢酶（Catalase，CAT）试剂盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）试剂盒，南京建成科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器，常州国宇仪器制造有限公司；721 型分光光度计，上海精密仪器公司；TG16B 实验室离心机，海南凯达科学仪器有限公司；HH-2 数显恒温水浴锅，常州荣华仪器制造有限公司；电子天平，沈阳龙腾电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓原浆抗氧化功能研究 选取清洁级昆明种（KM）雌性小鼠50 只，体质量在18～20 g，适应性饲养1 周后随机分为5 组，每组10 只。分别为正常对照组、花青素含量低（100 mg/kg）、中（150 mg/kg）、高（250 mg/kg）剂量组以及阳性对照组，具体灌胃剂量见表1。

表1 动物实验方法Table 1 Animal test method

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，4 000 r/min 离心3 min，取上清备用；断颈处死后取肝脏，用0 ℃生理盐水洗去表面血液，滤纸擦干后称质量，加入生理盐水制成10%肝脏匀浆。血清与肝脏匀浆均置于冰浴备用。采用试剂盒测定血清及肝脏总蛋白（TP）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活力、过氧化氢酶（CAT）活力以及丙二醛（MDA）含量。

1.3.2 缓解视疲劳功能研究 本试验于东北林业大学在校学生中选择18～22 岁具有视疲劳症状的志愿者共40 名，排除不符合纳入标准，未按规定饮用受试物者，最终有效受试者为39 名。具体分组试饮方法见表2。

表2 蓝莓原浆试饮试验方法Table 2 Test method for blueberry pulp

参照《保健食品检验与评价技术规范》 的规定，观察指标分为安全性指标与功效指标，本试验仅对蓝莓原浆对视疲劳的缓解功效进行分析测定。功效判断标准见表3。

表3 视疲劳症状判定方法（半定量积分法）Table 3 Determination method of visual fatigue symptom（Semi-quantitative integral method）

视疲劳即由于各种因素导致人眼在视物之时超过其视觉功能所能承受的负荷，而在用眼后出现视觉障碍、眼部不适或伴有全身症状等以致不能正常使用视功能的一组症候群[15]。主要体现为6大症状：眼胀、眼酸痛、眼畏光流泪、视物模糊、眼干涩以及眼异物感。为进一步全面掌握受试者试饮期间视疲劳改善情况，针对这6 大症状，试验人员通过设计调查问卷收集饮用蓝莓原浆期间各位受试者视疲劳的改善情况，打分标准见表4。

表4 日判定标准Table 4 Daily judgment criteria

1.4 数据处理和系统分析

2 结果与分析

2.1 蓝莓原浆抗氧化功能研究

2.1.1 蓝莓原浆对小鼠体质量的影响 体质量通常可以最直接地反映出动物的生存状态。进食、饮水异常，体内各个器官工作状态不佳的小鼠，通常会表现为小鼠体质量下降，毛发稀疏灰暗，精神状态萎靡。

如表5 所示，对小鼠进行灌胃处理之前，各剂量组之间小鼠体质量无显著差异（P＞0.05），说明分组前小鼠个体间身体状况相似，可以保证小鼠身体状况均处于同一水平。灌胃30 d 后，中剂量组小鼠体重与高剂量组相比差异性显著（P＜0.05），表明适量的蓝莓原浆可能对小鼠的进食具有促进作用，使小鼠体质量增加；而高剂量组小鼠体质量相比于灌胃前下降了2.28 g，可能是小鼠普遍的胃容量为1.5～2.0 mL，蓝莓原浆灌胃量增加占据了小鼠的胃部空间，导致小鼠进食量下降，饲料中的营养物质的摄入受到抑制，进而使小鼠体质量降低。

表5 蓝莓原浆对小鼠体质量的影响Table 5 Effects of blueberry pulp on body weight in mice

2.1.2 蓝莓原浆对小鼠脏器系数的影响 脏器系数能直观体现出受试物对小鼠脏器的影响。心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏是动物机体中参与代谢的重要器官，其发育状态可以反映出代谢机能同时能间接反映出生长状态[16]。

脏器系数见表6，各剂量组之间两两比较，心、肝、脾以及肾脏器系数均差异不显著（P＞0.05）；而对比肺脏器系数发现灌胃组小鼠的肺脏器系数偏小，考虑到给予小鼠的蓝莓原浆是由野生蓝莓全果压榨制成，浓稠并含有果肉的深蓝紫色液体状态，由于液体浓稠，导致灌胃难度加大，在小鼠挣扎过程中可能出现液体吸入气管从而对小鼠肺部造成负面影响。

表6 蓝莓原浆对小鼠脏器指数的影响Table 6 Effecs of blueberry pulp on organ index in mice

2.1.3 蓝莓原浆对小鼠血清及肝脏总蛋白（TP）含量的影响 蛋白质可以说是参与了包括疾病和健康在内的所有生命过程。最近一项深入的血清蛋白质组调查显示血清蛋白质网络与常见疾病密切相关[17]，突出了血清蛋白作为潜在病原体的生物标记物的新作用，在动物实验中血清及肝脏蛋白含量具有重要参考意义。

由图1 可知，空白对照组与灌胃组两两相比，血清蛋白含量均存在显著差异（P<0.05），由此推断蓝莓原浆可以增加小鼠血清蛋白含量，灌胃组小鼠的机体功能状态得到了一定程度的提高；同时中剂量组与阳性对照相比不存在显著差异（P>0.05），可知蓝莓原浆中剂量组中花青素对小鼠血清蛋白含量的增加作用与抗坏血酸相似。

图1 蓝莓原浆对小鼠血清蛋白及肝脏蛋白含量的影响Fig. 1 Effects of blueberry pulp on serum protein and liver protein content in mice

比较各剂量组间肝脏蛋白含量，灌胃组中肝脏蛋白含量虽稍高于对照组，但与对照组相比不存在显著差异（P>0.05）。

2.1.4 蓝莓原浆对小鼠体内SOD 活力的影响 SOD是在进化过程中形成的、广泛存在于生物体内，可有效清除超氧阴离子自由基的主要酶类之一，在抗氧化方面发挥了重要作用[18]。SOD 在有限的催化速率下，将超氧自由基分解为O2和H2O2，为机体抗氧化提供第一道酶防线[19]。不同剂量蓝莓花青素对小鼠肝脏及血清中SOD 酶活力的影响如图2 所示。

图2 蓝莓原浆对小鼠血清及肝脏中SOD 酶活力的影响Fig. 2 Effects of blueberry pulp on SOD activity in serum and liver of mice

随着蓝莓原浆用量的增加，小鼠肝脏中SOD酶活力呈上升趋势；中、高剂量组与空白对照组相比均存在显著差异（P<0.05）；同时中、高剂量组小鼠肝脏SOD 酶活力与阳性对照组相似，说明蓝莓原浆能够提高小鼠肝脏SOD 酶活力，并且与计量呈正相关关系。Chen 等[20]从山茱萸中提取出富含花青素的提取物ANF 也可通过提高小鼠体内SOD 酶活力达到提高抗氧化能力的目的，与本研究结果相似。

小鼠血清中SOD 酶活力虽随着蓝莓原浆用量的增加而略有增大，但各剂量组之间无显著差异（P>0.05）。综上可知剂量为250 mg/kg 对提高小鼠体内SOD 酶活力效果最佳。

2.1.5 蓝莓原浆对小鼠体内CAT 活力的影响 CAT作为一种含铁的同四聚体酶，主要作用为催化H2O2分解产生H2O 和O2[21]，在活性氧（Reactive oxygen species，ROS）清除过程中起着重要作用。

如图所3 示，当蓝莓花青素含量为100 mg/kg时，小鼠肝脏中CAT 酶活力最高，随着剂量增加CAT 酶活力呈下降趋势；阳性对照组小鼠体内CAT 酶活力最低；小鼠血清中CAT 酶活力也随着蓝莓原浆用量的增加而略有降低，差异不显著（P＞0.05）。由此可说明适量的蓝莓原浆摄入可对小鼠体内CAT 酶活力的增强起到促进作用，剂量为100 mg/kg 促进作用最大。

2.1.6 蓝莓原浆对小鼠体内MDA 含量的影响MDA 含量可反映出机体内脂质过氧化的程度，MDA 含量越少，说明机体细胞受损伤程度越小。

如图4 所示，灌胃组小鼠肝脏MDA 含量与对照组相比均有明显减少，说明蓝莓原浆与抗坏血酸对小鼠体内抗氧化起到了积极作用；当花青素剂量为150 mg/kg 时，小鼠肝脏MDA 含量最低，为（2.64±0.58）nmol/mg prot，并且与空白、低、高剂量组两两相比均存在显著差异（P＜0.05）；当蓝莓原浆灌胃量为0.53 mL，即花青素用量为250 mg/kg 时，小鼠血清中MDA 含量最低，且与其它剂量组相比均存在显著性差异（P＜0.05）。综合比较可知高剂量蓝莓原浆摄入可以明显降低小鼠体内MDA 含量，有效地抑制小鼠体内脂质过氧化作用。

图4 蓝莓原浆对小鼠血清及肝脏中MDA 含量的影响Fig. 4 Effects of blueberry pulp on MDA content in serum and liver of mice

2.2 蓝莓原浆缓解视疲劳功能研究

有研究表明，以花青素为代表的黄酮类化合物可能参与了涉及视觉生理学和眼睛健康不同过程中的2 个主要方面[22]：一是在视觉信号转导中发挥作用，而其机理目前尚不清楚；二是类黄酮也可能作为抗氧化剂发挥作用[23]，这在眼睛中尤其重要。相比于其它器官，眼部氧化应激十分显著，它的损害可导致包括黄斑变性在内的许多视觉病理问题。视觉疲劳即是眼部氧化应激的最初体现，因此本试验以视疲劳作为测定指标，通过体现疲劳程度的6 大症状来评估蓝莓原浆缓解视疲劳的能力。

2.2.1 蓝莓原浆对受试者眼胀与眼酸痛的改善效果 长时间的用眼导致睫状肌长时间的固定在一个姿势，处于紧张状态，逐渐失去原有的舒缩能力，即眼肌放松调节障碍。眼部毛细血管血液流通缓慢，眼部供氧不足，引起眼胀、眼酸痛症状。

由图5a 可以看出，试饮组中女性受试者在试饮30 d 左右，眼胀状况得到明显改善，并开始相对稳定地在3～4 分之间浮动；男性受试者在第13天就出现明显的改善情况，在试饮25 d 时打分情况相对稳定下来；女性试饮者在饮用蓝莓原浆第9 天时（见图5b），眼酸痛状况开始有所改善，而在试饮10～30 d 期间打分情况浮动相对加大。在试饮30 d 后，打分情况稳定在4 分左右。男性试饮者在试饮第7 天出现明显改善，而自此直到试饮结束打分情况均在3～4 之间出现不同程度的浮动。可见蓝莓原浆对男性眼胀及眼酸痛改善情况见效较快，这可能与男生好动，相比于女生户外活动以及体育锻炼更加频繁，眼部疲劳状况改善更明显有关。

图5 蓝莓原浆对视疲劳症状积分的影响Fig. 5 Effects of blueberry pulp on visual fatigue symptom score

2.2.2 蓝莓原浆对受试者眼畏光流泪与视物模糊的改善效果 畏光流泪与视物模糊通常发生在眼部疲劳程度较重，或眼部炎症存在的情况下，在一般人群中出现几率相较于其它几项疲劳症状出现几率较低。由于熬夜玩手机、睡眠质量不佳、用眼过度等不良习惯刺激，造成睑板腺油脂分泌功能障碍，使眼表润滑度降低，泪膜不稳定，形成畏光流泪，严重者导致视物模糊。

由图6a 可以看出，试饮组男性在第8 天后打分情况就基本稳定在4 分左右，女性在试饮第12天打分情况稳定在4 左右。说明蓝莓原浆对于缓解眼部畏光流泪状况效果良好。对照组中女性受试者打分情况极不稳定，几乎所有男性受试者在60 d 的试饮期间眼部畏光流泪状况没有得到改善。试饮20 d 后，试饮组男女受试者打分情况均在3～4 范围波动（见图6b），这是由于眼部畏光流泪及视物模糊的程度与当天人们用眼程度直接相关，导致对照组打分情况的较大波动。

图6 蓝莓原浆对视疲劳症状积分的影响Fig. 6 Effects of blueberry pulp on visual fatigue symptom score

2.2.3 蓝莓原浆对受试者眼干涩与眼异物感的改善效果 在视疲劳的6 大症状中，干眼的发生率和频率明显高于其他它眼部症状[24]，电子产品的蓝光会损伤角膜和泪膜，使泪膜的稳定性下降。长时间注视纸张或屏幕也导致眨眼频率减少，泪液缺乏或过度蒸发从而引起眼干。眼球转动过程中由于缺少泪液的润滑作用，对周围组织异物等敏感度增加，与眼皮之间的摩擦增大就会产生异物感。

由图7a 可以看出，试饮组中女性受试者在试饮第23 天时，眼干症状开始有明显改善，并在此以后分数均在4 左右波动。图7b 中女性受试者在第25 天眼异物感开始有明显改善，打分情况在4左右；而男性受试者在试饮第9 天时眼干与眼异物感症状均得到明显改善。

图7 蓝莓原浆对视疲劳症状积分的影响Fig. 7 Effects of blueberry pulp on visual fatigue symptom score

综上所述，饮用了蓝莓原浆的男性试饮者视力改善情况相较于女性试饮者效果更加明显，并且见效更快；而对照组中男性试饮者各症状几乎没有改善。这可能与个人生活作息、运动健身状况以及用眼习惯息息相关，具体原因有待进一步研究。

2.2.4 蓝莓原浆对受试者视疲劳症状改善效果总体分析 现代人们由于长时间暴露于电子产品之下，用眼时间大大延长，这就使得眼部受到氧化压力，即氧自由基等代谢废物不断增加，打破了自由基间的自我调节平衡[25]。自由基具有的一个额外未配对的电子导致其的不稳定性，同时也会给生物蛋白质及DNA 带来损伤[26]，反映到眼部的损害即为眼部视疲劳，其损害程度由视疲劳症状总积分体现。

由图8 可知，食用本试验蓝莓原浆60 d 后，男女试饮者视疲劳症状总积分均有下降趋势。其中男性试饮者效果显著（P<0.05），其总积分下降了2.30。对照组在试饮前、后数据差异无明显变化（P>0.05）。由此可见，饮用蓝莓原浆后，人们整体视疲劳状况得到了改善，蓝莓原浆有助于缓解人们眼部疲劳状况，并进一步对视力产生良性作用。

2.2.5 明视持久度变化 明视持久度（Duration of photopic vision）表示为明视时间与注视时间的百分比，如今被广泛用于评价人体视疲劳程度。明视持久度越大，说明眼部状态越好，疲劳程度越小。

由图9 可知，经过60 d 的试饮期后，试饮组明视持久度增加。女生明视持久度由0.58±0.08 增加至0.61±0.07；男生明视持久度增加更为显著（P<0.05），由0.52±0.05 增加至0.65±0.06，说明蓝莓原浆对试饮组同学视疲劳状况起到了良好的改善作用，并在男性群体中体现更为显著。

图9 蓝莓原浆对明视持久度的影响Fig. 9 Effects of blueberry pulp on duration of photopic vision

3 结论

本试验以原花青素含量为11.6 g/L 的蓝莓原浆为研究对象，经动物实验与人体试饮试验表明高剂量蓝莓原浆（花青素含量为250 mg/kg）摄入可以提高小鼠体内SOD 酶活力同时显著降低MDA 含量；低剂量蓝莓原浆（花青素含量为100 mg/kg）摄入可对小鼠体内CAT 酶活力的增强起明显促进作用；人体试饮本试验蓝莓原浆60 d后，试饮组视疲劳症状及明视持久度均得到良好改善，并在男性群体中体现出显著性。综上，长期食用蓝莓原浆有助于提高机体抗氧化能力，进而可以达到保护视网膜，缓解视疲劳的作用。