低共熔溶剂提取鱼腥草中绿原酸工艺优化

顾东雅，金绍娣，谢佳伶，史怡颖

（盐城工业职业技术学院药品与健康学院，江苏 盐城 224000）

鱼腥草俗称折耳根，具有清热解毒、利尿消肿的功效［1］，具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力、化痰、利尿、抗癌等作用［2-4］。绿原酸是鱼腥草中活性成分之一，具有增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降压降脂、抗艾滋病作用［5-6］。目前，对于绿原酸提取方法主要是酶法、微波、超声波等［7］，主要采用传统的有机溶剂，对环境不友好［8］，探索一种绿色高效提取方法很有必要。低共熔溶剂是由氢键接受体和氢键提供体组成的共熔混合物［9］，溶解度高、可生物降解、无毒［10-11］，具有原料成本低、合成简单、不产生三废等优点［12］。目前，以鱼腥草为原料提取绿原酸的文献报道较少，而且低共熔溶剂提取鱼腥草中绿原酸也尚未有研究报道。

本实验制备7 种低共熔溶剂并进行筛选，以筛选后的低共熔溶剂提取鱼腥草中的绿原酸，以绿原酸提取率为评价指标，单因素试验考察低共熔溶剂含水量、料液比、提取温度和时间对提取率的影响； 正交试验优化提取工艺，与水、60%乙醇等传统溶剂进行比较，以期为低共熔溶剂在鱼腥草绿原酸的高效提取提供科学依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 鱼腥草购于颂药堂精品药材店，经江苏天宇检测技术有限公司裴丽高级研究员鉴定为正品。绿原酸对照品（分析纯，广州市江顺化工科技有限公司）。氯化胆碱、尿素（分析纯，茂名市雄大化工有限公司）。乙腈（色谱纯，济南元素化工有限公司）； 乙二醇、丙三醇、1，4 丁二醇、丁二酸、柠檬酸、乙酸、甲醇均为分析纯。

1.2 仪器 FA2204B 电子分析天平（济南程腾生物技术有限公司）； UV759 高分辨紫外分光光度计（青岛聚创华业分析仪器有限公司）； Prominence LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）； HJ-6 恒温磁力搅拌器（深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司）； KS50R 高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）； LAB-BL2 冷冻干燥机（悦高致实验仪器有限公司）。

2 方法

2.1 低共熔溶剂制备 将氢键接受体氯化胆碱与氢键提供体乙二醇、丙三醇、1，4 丁二醇、尿素、乳酸、柠檬酸、乙酸等按一定比例置于圆底烧瓶中，60～85 ℃水浴加热1～2 h，磁力搅拌混合均匀，直至溶液澄清，干燥，冷却至室温，即得［13］。

2.2 绿原酸提取 按照文献［14］ 报道精密称取2.50 g鱼腥草药材粉末若干份，置于圆底烧瓶中，加入低共熔溶剂，控制料液比、温度、时间和含水量，提取绿原酸，离心分离，上清液置于100 mL 量瓶中，乙腈-水（25 ∶75）定容至刻度，计算提取率，公式为提取率＝ （c×V×n/m） ×100%，其中c为提取液中绿原酸质量浓度，V为提取液体积，n为提取液稀释倍数，m为鱼腥草质量。

2.3 对照品溶液制备 按照文献［15］，精密称取5.25 mg 绿原酸对照品，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得。

2.4 色谱条件 流动相乙腈-水（25 ∶75）； 体积流量1 mL/min； 柱温室温； 检测波长327 nm； 进样量25 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 分别取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 对照品溶液，置于10 mL 量瓶中，定容至刻度。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝4 608X＋2.845 （r＝0.999 6），在0.102 ～0.637 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液25 μL，在“2.4” 项色谱条件下进样测定6 次，测得绿原酸峰面积RSD 为0.36%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取同一份绿原酸提取液适量，在“2.4” 项色谱条件下进样测定6 次，测得提取率RSD 为0.42%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取绿原酸提取液适量，于1、6、12、24、36、48 h 在“2.4” 项色谱条件下进样测定，测得绿原酸含量RSD 为1.49%，表明提取液在48 h 内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取绿原酸含量已知的提取液6 份，精密加入0.21 mg/mL 对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，在“2.4” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸平均加样回收率为99.21%，RSD 为1.00%。

2.6 单因素试验

2.6.1 低共熔溶剂组成 本实验采用氯化胆碱作为氢键受体，与不同氢键供体（乙二醇、丙三醇、1，4 丁二醇、尿素、乙酸、丁二酸、柠檬酸） 制备低共熔溶剂，固定含水量20%，料液比1 ∶30，提取温度60 ℃，提取时间40 min，考察氯化胆碱与氢键供体比例1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5对绿原酸提取率的影响。

2.6.2 含水量 以氯化胆碱-乙酸（1 ∶3） 为提取剂，固定料液比1 ∶30，提取温度60 ℃，提取时间40 min，改变氯化胆碱-乙酸体系中的含水量 （0、10%、20%、30%、40%、50%、60%），考察其对绿原酸提取率的影响。

2.6.3 料液比 以氯化胆碱-乙酸（1 ∶3） 为提取剂，固定含水量为20%，提取温度60 ℃，提取时间40 min，改变料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50），考察其对绿原酸提取率的影响。

2.6.4 提取温度 以氯化胆碱-乙酸（1 ∶3） 为提取剂，固定含水量20%，料液比1 ∶30，提取时间40 min，改变提取温度 （ 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃），考察其对绿原酸提取率的影响。

2.6.5 提取时间 以氯化胆碱-乙酸（1 ∶3） 为提取剂，固定含水量20%，料液比1 ∶30，提取温度60 ℃，改变提取时间 （10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min），考察其对绿原酸提取率的影响。

2.7 正交试验 基于单因素试验，以氯化胆碱-乙酸（1 ∶3） 为提取剂，选取料液比、提取温度和提取时间作为影响因素，绿原酸提取率作为评价指标，设计正交试验。

2.8 数据处理 单因素试验平行3 次，取平均值，采用正交设计助手、Excel 等软件进行分析。

3 结果

3.1 单因素试验

3.1.1 不同组成的低共熔溶剂 由表1 可知，随着比例增大绿原酸提取率先升高后降低，为1 ∶3 时最高，主要是由于比例变化导致提取液中氢键的网格体系变化，从而使其扩散系数、极性等性质发生变化。当氢键供体为多元醇时，绿原酸的提取率普遍较低； 当氢键供体为尿素时，绿原酸提取率最低； 当氢键供体为有机酸时，绿原酸的提取率普遍较高，因为绿原酸在氢键供体呈碱性时结构不稳定，易被破坏； 酸性条件下最稳定，表现出较高的提取率，但柠檬酸是三元羧酸，使得提取绿原酸时受到一定的阻力，故提取率较其他有机酸略低。最终，选择氯化胆碱-乙酸比例1 ∶3。

表1 不同低共熔溶剂对绿原酸提取率的影响

3.1.2 含水量 由图1A 可知，绿原酸提取率随氯化胆碱-乙酸体系中含水量的增加先升高后降低，为20% 时最高，主要是因为氯化胆碱-乙酸体系通过氢键连接，而水作为极性溶剂能降低其黏度，增大扩散系数，从而提高对绿原酸的提取能力； 但含水量过高时会导致体系极性过大，引起氢键断裂，从而影响绿原酸的提取。最终，选择含水量20%。

图1 单因素试验结果

3.1.3 料液比 由图1B 可知，绿原酸的提取率随料液比的增大逐渐升高，为1 ∶30 时最高，之后再增大时提取率变化不大甚至略有下降，因为料液比增大降低了氯化胆碱-乙酸体系的黏度，增加了扩散性，从而提高了体系的提取率； 当提取液中绿原酸已达到一定的饱和度时再增大料液比对提高提取率作用不大，反而导致提取出的绿原酸重新吸附到原待提物中，使其略有下降。最终，选择料液比1 ∶30。

3.1.4 提取温度 由图1C 可知，绿原酸提取率随温度增加先升高后降低，为60 ℃时最高，主要是因为温度较低时氯化胆碱-乙酸与绿原酸结合作用力较弱，不利于后者溶出，从而提取率较低； 温度升高能使体系的黏度下降，扩散系数提高使得扩散速率增加，同时提高绿原酸的溶出；但绿原酸本身不稳定，对强光和高温很敏感，若继续升高温度会导致其结构改变，使得提取率降低。最终，选择提取温度60 ℃。

3.1.5 提取时间 由图1D 可知，绿原酸提取率随时间延长先快速升高，为60 min 时最高，随后趋于平缓，变化不大，主要是因为60 min 后提取液中绿原酸基本饱和，再延长时间对其提取帮助较小。最终，选择提取时间60 min。

3.2 正交试验 依据单因素试验结果，以绿原酸提取率为评价指标，料液比、提取温度、提取时间为影响因素，每个因素3 个水平［16］，具体见表2，结果见表3。

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验结果

由表3 可知，料液比对绿原酸提取率的影响最主要，各因素影响次序为A＞B＞C，最优提取工艺为A2B3C2，即料液比1 ∶30，提取温度70 ℃，提取时间60 min，提取率为5.43%，与单因素试验中在料液比1 ∶30、提取温度60 ℃、提取时间60 min 条件下提取率为5.32%基本接近。从实际考虑，最终确定最优工艺为提取溶剂氯化胆碱-乙酸（1 ∶3），含水量20%，料液比1 ∶30，提取温度70 ℃，提取时间60 min。

3.3 提取结果比较 以料液比1 ∶30、提取温度70 ℃、提取时间60 min 为提取工艺，采用水、60%乙醇、氯化胆碱-乙酸（1 ∶3，含水量20%） 作为提取剂对鱼腥草中的绿原酸进行提取，重复3 次，取平均值。由表4 可知，相同条件下低共熔溶剂对鱼腥草中绿原酸的提取率明显高于传统溶剂，可实现高效提取的优点。

表4 2 种溶剂提取结果比较

4 结论

文献［17］ 中提取鱼腥草最佳提取溶剂是60%的乙醇，而本实验发现氯化胆碱与不同氢键供体共混，氢键供体呈酸性且比例为1 ∶3 时绿原酸提取率最高，原因可能是绿原酸在酸性条件比较稳定，氯化胆碱分别与氢键供体乙酸、丁二酸、柠檬酸组成的低共熔溶剂体系使得提取液中氢键的网格体系发生变化，使其扩散系数、极性等性质也发生变化，更利于绿原酸溶出，但多元羧酸又阻碍了绿原酸的进一步提取。另外，低共熔溶剂体系中含水量对绿原酸的提取率也有较大的影响，无水时体系黏度高，流动性差，低共熔溶剂不利于渗透入提取液中，从而不利于绿原酸的提取； 当低共熔溶剂体系中加入一定量的水时，可使体系黏度下降，低共熔溶剂能较好进入提取液的基质内部，破坏植物细胞壁，利于绿原酸的提取，但含水量过高，也不利于绿原酸的提取，最后筛选出氯化胆碱-乙酸（1 ∶3，含水量20%） 为最佳提取溶剂，具有制备简单、提取率高、可生物降解、不产生三废等优点［8］，为其在天然植物方面的提取及绿原酸提取新工艺提供了参考。