科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞的保护作用

贾 享，贺武斌，杨秋实，黄建华

（锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000）

阿霉素是临床上常见的蒽环类抗肿瘤药物［1］，具有较高的心肌亲和力，其频繁的使用及剂量的累积常导致肿瘤患者出现不同程度的心肌损伤［2］。目前关于阿霉素心肌损伤的作用机制仍不清楚，普遍认为其主要机制是氧化应激，氧化应激本质是抗氧化剂的消耗或活性氧（ROS） 的积累导致氧化和抗氧化系统失衡［3］。其中大量研究表明，过量ROS 产生可以导致DNA、蛋白质和脂质的损伤引起细胞的死亡，如凋亡［4］、自噬［5］、焦亡［6］及铁死亡［7］。因此积极寻找并开发药物对阿霉素心肌损伤的治疗具有重大意义。随着中医药现代化不断发展，大量中药及其单体在不同疾病领域发挥的药理作用备受关注，是当前研究的热点。

科罗索酸是从山楂果、枇杷叶或者大花蔷薇中提取的一种五环三萜类化合物［8］，具有广泛的药理活性，包括降糖［9］、抗炎［10］、抗肿瘤［11］及保护心血管［12］。姜华等［13］发现，科罗索酸可以提高糖尿病大鼠心肌细胞抗氧化应激能力来降低心脏损伤。Li 等［14］报道，科罗索酸以AMPK 依赖性方式调节Drp1 磷酸化增强内皮细胞抗氧化应激能力，改善受损线粒体功能。由于科罗索酸在阿霉素心肌损伤中的作用研究较少，因此本研究通过建立阿霉素心肌细胞损伤模型，探索科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 科罗索酸（纯度＞98%，批号JZ21031721） 购自南京景竹生物科技有限公司。Nrf2 抑制剂 （ ML385，纯度≥99%，批号L17D9L77422）、右丙亚胺 （dexrazoxane，DEX，纯度≥98%，批号H21M9Z61735） 均购自上海源叶生物科技有限公司； 阿霉素（批号A1832） 购自美国APExBIO 公司； MTT （批号M6180） 购自北京博奥拓达科技有限公司； 胎牛血清（FBS，批号JC63441） 购自美国CLARK Bioscience 公司；DMEM/HIGH GLUCOSE 培 养 基 （ 批 号AG29643090） 购自美国HyClone 公司； Hoechst 33342 试剂盒（批号072221220411）、活性氧检测试剂盒（批号061521210723）、Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（批号021921210630）、ECL 化学发光试剂盒（批号05202121210715） 均购自上海碧云天生物技术有限公司； 铁离子检测试剂盒（批号2021O0HE1042） 购自北京普利莱基因技术有限公司； 抗体Bax （批号M09231637）、抗体Bcl-2 （批号H09301556）、抗体cleaved Caspase 3（批号M04142117）、抗体Nrf2 （批号I02212135）均购自沈阳万类生物科技有限公司； β-actin （批号AC21111012A） 购自武汉赛维尔生物科技有限公司； 抗体Ptgs2 （批号86f4760）、抗体GPX4 （批号78p5366） 均购自美国Affinity 公司； 山羊抗兔IgG HRP （批号22181594） 购自合肥白鲨生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 大鼠H9c2 心肌细胞由锦州医科大学附属第一医院外科学重点实验室赠予。用含10% FBS、1%双抗的DMEM 高糖培养基培养H9c2心肌细胞，放置于37 ℃、5% CO2培养箱中，1 ～2 d换液1 次，待细胞密度为90%时传代，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 细胞分组 细胞分为空白组、模型组 （1 μmol/L 阿霉素）、阳性组（1 μmol/L 阿霉素＋20 μmol/L DEX）、科罗索酸组（1 μmol/L 阿霉素＋5 μmol/L 科罗索酸） 及Nrf2 抑制剂组（1 μmol/L 阿霉素＋5 μmol/L 科罗索酸＋20 μmol/L ML385）。

1.4 MTT 法检测细胞活性 制备密度6×104/mL的H9c2 心肌细胞悬液，以100 μL/孔接种于96 孔培养板中，每组设置6 个复孔。①检测不同浓度科罗索酸 （0、0.5、1、5、10、20、50、80、100 μmol/L） 对H9c2 心肌细胞毒性； ②检测不同浓度科罗索酸 （0、0.5、1、5、10、20、50 μmol/L）及DEX （20 μmol/L） 分别与阿霉素（1 μmol/L）共同处理H9c2 心肌细胞的存活率。按分组处理24 h后加入20 μL/孔MTT 液（5 mg/mL），置于37 ℃培养箱培养4 h 后，弃去上层液体，再加入150 μL/孔DMSO，于摇床充分振荡溶解紫色结晶，用酶标仪在490 nm 波长处测量光密度（OD） 值。计算细胞增殖率，公式为细胞增殖率＝ （给药组OD 值/对照组OD 值） ×100%，实验重复3 次。

1.5 Hoechst 33342 染色检测细胞凋亡 按“1.2”“1.3” 项下条件处理并收集细胞，每孔加入1 mL 10 mg/L Hoechst 33342 染液，放入培养箱中继续培养20～30 min，弃去染液，PBS 洗涤3 次，用荧光倒置显微镜观察并拍照，实验重复3 次。

1.6 ROS 试剂盒检测活性氧水平 按 “1.2”“1.3” 项下条件处理并收集细胞，PBS 洗涤1 次，每孔加入1 mL 10 μmol/L DCFH-DA 荧光探针的无血清培养基，放入培养箱孵育，20 min 后弃去染液，PBS 洗涤3 次，用荧光倒置显微镜观察并拍照，实验重复3 次。

1.7 铁离子比色法检测细胞Fe2＋水平 按“1.2”“1.3” 项下条件处理并收集细胞，加入裂解液置于摇床裂解2 h 后收集不同分组标本。按照铁离子比色法检测试剂盒说明书操作，将裂解的样品与混液A 混匀，60 ℃孵育1 h，冷却至室温后加入铁离子检测试剂，常温孵育30 min，在550 nm 波长处测定OD 值，根据标准曲线计算铁离子浓度，实验重复3 次。

1.8 Annexin V/PI 法检测细胞凋亡率 按“1.2”“1.3” 项下条件处理并收集细胞，用不含EDTA的0.25%胰酶进行消化，离心收集细胞，用500 μL Annexin V 结合液重悬细胞后，依次加入Annexin V-FITC 染液5 μL 和PI 染液10 μL，2 ～8 ℃避光孵育15 min，最后用流式细胞仪上机分析细胞凋亡率，实验重复3 次。

1.9 Western blot 法检测Bax、cleaved-caspase3、Bcl-2、Nrf2、GPX4 及Ptgs2 蛋白表达 按“1.2”“1.3” 项下条件处理并收集细胞，裂解细胞后，提取上层蛋白溶液进行BCA 定量，电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF 膜上，用2% BSA 封闭2 h，孵育一抗（1 ∶1 000）、二抗（1 ∶1 000），ECL 发光液显影，实验重复3 次，应用Image J 软件进行灰度分析。

1.10 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 科罗索酸对H9c2 心肌细胞活力的影响 与空白组比较，0.5 ～10 μmol/L 科罗索酸对H9c2 心肌细胞活力没有影响（P＞0.05），20 ～100 μmol/L科罗索酸呈浓度依赖性降低H9c2 心肌细胞活力（P＜0.01），见图1。

图1 科罗索酸对H9c2 心肌细胞活力的影响（±s，n＝6）Fig.1 Effects of corosolic acid on the viability of H9c2 cardiomyocytes （±s，n＝6）

2.2 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞活力的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞活力降低（P＜0.01）； 与模型组比较，0.5 μmol/L科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞活力无明显影响（P＞0.05），阳性组及1 ～10 μmol/L 科罗索酸能提高阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞活力（P＜0.01），见图2。

图2 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞活力的影响（±s，n＝6）Fig.2 Effects of corosolic acid on the viability of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝6）

2.3 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞凋亡的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞数量减少，细胞核呈现致密浓染及亮蓝色荧光，细胞凋亡率升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性组及科罗索酸各剂量组H9c2 心肌细胞数量增多，细胞核呈现致密浓染数量减少及亮蓝色荧光降低，细胞凋亡率降低（P＜0.01），见图3。

图3 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞凋亡的影响（±s，n＝3）Fig.3 Effects of corosolic acid on the apoptosis of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.4 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞ROS 水平的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞产生大量ROS 并呈现强绿色荧光 （P＜0.01）； 与模型组比较，阳性组及科罗索酸各剂量组H9c2 心肌细胞ROS 水平降低并呈现暗绿色荧光（P＜0.01），见图4。

图4 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞ROS 水平的影响（±s，n＝3）Fig.4 Effects of corosolic acid on the ROS level of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.5 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞Fe2＋水平的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞Fe2＋水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，阳性组及科罗索酸各剂量组H9c2 心肌细胞Fe2＋水平降低（P＜0.01），见图5。

图5 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞Fe2＋水平的影响（±s，n＝3）Fig.5 Effects of corosolic acid on the Fe2＋level of H9c2 cardiomyocytesafterdoxorubicin induction （±s，n＝3）

2.6 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞凋亡率的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞凋亡率升高（P＜0.01）； 与模型组比较，科罗索酸组H9c2 心肌细胞凋亡率降低（P＜0.01），见图6。

图6 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞凋亡率的影响（±s，n＝3）Fig.6 Effects of corosolic acid on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.7 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞Bax、Bcl-2、cleaved-caspase3 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.01），Bax 及cleaved-caspase3 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与模型组比较，科罗索酸组H9c2 心肌细胞Bcl-2 蛋白表达升高（P＜0.01），Bax 及cleaved-caspase3 蛋白表达降低（P＜0.01），见图7。

图7 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞Bax、Bcl-2 及cleaved-caspase3 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.7 Effects of corosolic acid on the protein expressions of Bax，Bcl-2 and cleaved-caspase3 in H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.8 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞Nrf2、GPX4 及Ptgs2 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞GPX4 及Nrf2 蛋白表达降低 （P＜0.01），Ptgs2 蛋白表达升高 （P＜0.01）； 与模型组比较，科罗索酸组H9c2 心肌细胞GPX4 及Nrf2 蛋白表达升高（P＜0.01），Ptgs2蛋白表达降低（P＜0.01），见图8。

图8 科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞Nrf2、GPX4 及Ptgs2 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.8 Effects of corosolic acid on the protein expressions of Nrf2，GPX4 and Ptgs2 in H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

2.9 Nrf2 抑制剂联合科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞GPX4 蛋白表达的影响 与空白组比较，模型组H9c2 心肌细胞GPX4 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，科罗索酸组H9c2 心肌细胞GPX4 蛋白表达升高（P＜0.01）； 与科罗索酸组比较，Nrf2 抑制剂组H9c2 心肌细胞GPX4 蛋白表达降低（P＜0.01），见图9。

图9 Nrf2 抑制剂联合科罗索酸对阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞GPX4 蛋白表达的影响（±s，n＝3）Fig.9 Effects of Nrf2 inhibitor combined with corosolic acid on the protein expression of GPX4 in H9c2 cardiomyocytes after doxorubicin induction （±s，n＝3）

3 讨论

阿霉素是常见的化疗药物，但对心脏具有毒性。当心肌细胞受到阿霉素刺激后，会产生ROS导致心功能障碍。ROS 主要是由线粒体产生，是有氧代谢过程中产生的副产物，在线粒体代谢和维持稳态平衡中发挥重要作用［15］。ROS 可以导致细胞凋亡。在细胞凋亡的调节中Bcl-2 家族的蛋白质起关键作用，Bax 是Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，细胞受到损伤时，Bax 从胞质转位到线粒体表面，增加线粒体通透性，导致细胞色素C 外漏，活化下游的casepase3，激活线粒体细胞凋亡途径［16］。Chu 等［17］发现FGF1 可以通过抑制ROS，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，降低Bax 及caspase3 蛋白表达，抑制H2O2诱导的H9c2 心肌细胞凋亡，在阿霉素心肌损伤中同样发挥重要角色。Sirangelo 等［18］研究结果显示，Hydroxytyrosol 能够通过作用于SOD2 水平和氧化反应以及Bcl-2/Bax 介导的凋亡机制来抵消阿霉素诱导的心肌细胞毒性。本研究发现，采用1 μmol/L 阿霉素处理24 h 后，H9c2 心肌细胞内ROS 水平升高，细胞活力降低，凋亡率升高，凋亡蛋白Bax 及cleaved-caspase3 表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达降低。加入科罗索酸干预后，能提高H9c2 心肌细胞活力，降低H9c2 心肌细胞凋亡率及ROS 水平，降低凋亡蛋白Bax 及cleavedcaspase3 表达，升高抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，表明科罗索酸能够通过降低ROS 抑制阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞凋亡。

同样ROS 也能导致细胞铁死亡。铁死亡是一种新的细胞死亡方式，其本质是铁累积和脂质过氧化产生［19］。ROS 在脂质过氧化中起关键作用，细胞内ROS 水平的改变可诱发细胞铁死亡的发生。抗氧化系统的相关蛋白Nrf2、GPX4 及脂质过氧化相关蛋白Ptgs2 都是铁死亡的标志性蛋白。Nrf2 是细胞内源性抗氧化分子，是一种重要的转录因子。在正常生理条件下，Nrf2 在细胞质中与Keap1 结合，然后Nrf2 被泛素-蛋白酶体系统降解。在氧化应激的情况下，Nrf2 从Keap1 解离并转移到细胞核，调控GPX4 及Ptgs2 等下游基因的转录发挥抗氧化作用抑制铁死亡［20］。Wang 等［21］研究发现，硫化氢可以激活Nrf2/GPX4 通路抑制铁死亡来减轻颗粒物引起的肺气肿和气道炎症。Lu 等［22］研究结果显示，丙泊酚通过激活Nrf2/GPX4 信号通路抑制铁死亡，增加细胞活力并抑制H9c2 心肌细胞的凋亡、氧化应激和炎症反应减轻阿霉素心肌细胞损伤。本研究发现，科罗索酸能够抑制Fe2＋水平，增强Nrf2 及GPX4 蛋白表达，抑制Ptgs2 蛋白，进而抑制阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞铁死亡。为了验证科罗索酸是否作用于Nrf2 通路，通过加入ML385 抑制剂后，发现GPX4 蛋白表达被抑制，由此推测Nrf2 可能是科罗索酸的作用靶点。

综上所述，科罗索酸能抑制阿霉素诱导的H9c2 心肌细胞ROS 水平及细胞凋亡，并可能通过激活Nrf2/GPX4 通路抑制细胞铁死亡。