氨基化-多壁碳纳米管QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定热带水果中110 种农药及其代谢物残留量

潘永波, 张妙宜, 万 娜, 王 彬*,, 潘灿平

(1.海南省检验检测研究院食品检验检测中心 国家市场监管重点实验室(热带果蔬质量与安全)，海口 570314；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101；3.中国农业大学 理学院，北京 100193)

热带水果在种植过程中由于所处环境温度高、湿度大，易受病虫危害，生产中常采用化学农药进行防治[1-2]，而其频繁或不合理使用可能导致农药残留问题突出，威胁消费者健康和生态环境[3-4]。在进行农药残留检测时，由于荔枝、龙眼、香蕉中富含糖类物质，利用传统QuEChERS前处理方法处理时易产生糖析现象[5]，造成部分农药损失；此外果实中富含的色素，可以增强大部分农药的基质效应[6]，从而影响检测的准确度。有文献报道了采用气液微萃取技术[7]、微波辅助盐析萃取技术[8]和改进的QuEChERS 方法[9]检测高糖、含有色素的水果、蜂蜜等基质中的多农药残留，但对高糖、含有色素的新鲜热带水果检测多农药残留报道较少。

Anastassiades 等[10]在2003 年首次提出采用QuEChERS 前处理技术用于果蔬中多农药残留的检测，近些年，学者在食品中农药残留、兽药残留、真菌毒素和环境污染物等方面也展开了相关研究[11-13]，丰富了QuEChERS 方法应用范围。研究发现，使用传统的净化填料难以满足复杂的食品基质[14]，对净化材料的性能提出了更高要求，因此，新型高效的净化材料已成为QuEChERS 方法发展的一个重要方向。

近些年，多壁碳纳米管 (multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs) 被学者们广泛关注[15-16]。MWCNTs 是由碳原子组成的平面六边形经卷曲形成的一种多孔石墨圆筒状并具有纳米尺度的碳材料，具有比表面积大、吸附能力强、稳定耐用等特点[17]。与石墨化碳黑 (graphitized carbon black，GCB) 相比，MWCNTs 对色素、酚类、甾醇类等物质的吸附能力更强[17]，但对平面结构的农药吸附能力较低。通过对MWCNTs 的官能团进行修饰，可使其具有更好的净化能力。如彭晓俊等[18-19]对MWCNTs 进行氧化修饰，使其带有羟基和羧基，用其对陈皮及其制品进行净化，能有效去除样品中的杂质，基质效应降低；应用氨基化-多壁碳纳米管 (NH2-MWCNTs) 对牛奶[20]和菊花[21]进行净化时发现， NH2-MWCNTs 能吸附基质中的大部分杂质，从而减少基质对农药多残留检测的影响。

本研究在QuEChERS 方法基础上，参照现行国家标准方法[22]，比较分析了NH2-MWCNTs 及GCB 的净化效果，通过优化NH2-MWCNTs 含量，建立了基于NH2-MWCNTs 改进的QuEChERS净化法，结合液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 测定荔枝、龙眼和香蕉中110 种农药及其代谢物残留的检测方法，旨在为热带水果中农药多残留的日常监测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQ-S 液相色谱-串联质谱联用仪，美国Waters 公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱，美国Waters 公司；XS204万分之一天平，瑞士 Mettler Toledo 公司；XW-80A 旋涡混合器，上海精科实业有限公司；IKA®KS 4000 ic 恒温摇床，德国IKA 公司；Centrifuge 5804R 冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；Milli-Q超纯水机，美国Millipore 公司。

乙腈、甲醇(色谱纯)，德国MERCK 公司；甲酸、乙酸(色谱纯)，美国ACS 恩科化学；乙酸铵(色谱纯)，美国Thermo Fisher 公司；EN.15662萃取缓冲体系QuEChERS 盐包(含4 g MgSO4、1 g氯化钠、0.5 g 柠檬酸氢二钠和1 g 柠檬酸钠)，美国Agilent 公司；多壁碳纳米管(NH2-MWCNTs，粒径10～20 nm，颗粒长度5～15 μm)，北京科德诺思技术有限公司；石墨化碳黑(GCB)，天津博纳艾杰尔科技有限公司；N-丙基乙二胺(PSA，粒径40～60 μm，平均孔径6 nm，天津博纳艾杰尔科技有限公司；荔枝、龙眼和香蕉，购自海南省海口市、澄迈县、东方市、昌江市等地的农贸市场及超市。

110 种农药标准品 (纯度≥95.0%)，分别购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司、美国CATO 公司和中国计量科学研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取10 mg (精确至0.1 mg) 各农药标准品，根据标准品的溶解性分别选择乙腈或甲醇为溶剂，配制成1000 mg/L 的标准品储备液，于 -18 ℃及以下保存；根据需要，移取适量标准品储备液用乙腈稀释，配制成所需浓度的标准工作液，于4 ℃保存，备用。

1.2.2 样品前处理 样品制备：按照GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[23]方法，取供试水果待测部位，用组织捣碎机匀浆后，放入聚乙烯瓶中，于 -18 ℃及以下保存。

提取：称取10 g (精确至0.01g) 均质样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 乙腈，涡旋混匀1 min后，加入EN.15662 萃取缓冲体系QuEChERS盐包，振摇1 min，以8000 r/min 离心5 min。

净化：移取6 mL 上清液，加入到含有900 mg MgSO4、150 mg PSA 及15 mg MWCNTs 的15 mL离心管中，涡旋1 min 后，以8000 r/min 离心5 min；取上清液过0.22 μm 有机滤膜，待测。

1.2.3 检测条件 色谱条件：采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 (1.8 μm，2.1 mm × 100 mm)分离；流动相A 相为0.01%甲酸水溶液 (含2 mmol/L乙酸铵)，B 相为甲醇；流速0.4 mL/min； 柱温40 ℃； 进样量1 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min，98% A；＞0.5～3.5 min，2.0% A；＞3.5～4.5 min，2.0% A；＞4.5～4.6 min，98% A；＞4.6～6.0 min，95% A。

质谱条件：电喷雾离子源 (ESI 离子化模式)，正离子和负离子同时扫描；多反应监测模式(MRM)；碰撞气为氩气 (Ar)；毛细管电压1.00 kV(ESI+)、2.5 kV (ESI-)；离子源温度120 ℃；锥孔气流量150 L/h；脱溶剂气温度400 ℃；脱溶剂气流量800 L/h。其他质谱条件详见表1。

表1 110 种农药质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 110 pesticides

1.3 数据处理

数据采用Waters MassLynx 工作软件建立方法、数据采集及定量处理，导出原始数据后采用WPS Office 进行数据整理、分析和表格、柱状图绘制。前处理和分析条件优化中的回收率均采用3 个平行样品取平均值计算，精密度选择低、中、高3 个浓度，每个浓度梯度连续采集6 次数据的峰面积进行相对标准偏差 (RSD) 的计算。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

为了实现110 种化合物有较好的色谱行为，实验首先考察了乙腈-水、甲醇-水在HSS T3 色谱柱上相同洗脱梯度条件下各化合物的响应和分离度。结果发现，在只有纯水和有机相下，大多数农药响应较差，甚至没有出峰，因此在水相中添加一定浓度的甲酸或乙酸铵，观察各化合物的响应及出峰时间的变化。实验发现，在水相中加入一定浓度的甲酸，有机磷类等农药的响应值显著增加，说明甲酸可以增强该类农药的电离；当加入乙酸铵时，有机氯及拟除虫菊酯类等农药有较好的峰形和响应值，这是因为该类农药离子化时，铵盐促进了[M + NH4]+峰的形成，容易在流动相中分散和传递[24-25]。进一步考察了在水相中分别添加体积分数为0.01%、0.05%、0.1%和0.2%的甲酸及浓度单位为1、2、5 和10 mmol/L 乙酸铵，观察对各化合物的影响。结果表明，当甲酸浓度增加时，甲胺磷基线噪音增大，影响峰形；当乙酸铵浓度增加到5 mmol/L 时，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、多杀菌素等峰形变宽，出峰时间延迟。为了使各化合物有更好的分析，水相选择加入0.01%甲酸和2 mmol/L 乙酸铵。由于甲醇为质子溶剂，与亲核基形成氢键，对分离酸碱或电负性强的化合物有较强的选择性[26]，因此有机相选择甲醇。最终选择2 mmol/L 乙酸铵的水相 (含有0.01%甲酸) 与甲醇为流动相。

2.2 前处理条件优化

2.2.1 提取溶剂优化 参照GB 23200.121—2021《食品安全国家标准 植物源性食品中331 种农药及其代谢物残留量的测定》，分别选择乙腈及含有体积分数为1%乙酸的乙腈作为提取溶剂，在荔枝空白基质中添加供试目标农药标准品，添加水平为0.02 mg/kg。结果发现，两种提取溶剂对应各目标农药的回收率分别为51.7% 和56.7%，说明仍有大量的农药未被提取出来，可能是因为荔枝中含有大量的糖类物质，导致出现糖析现象，降低了农药的提取效率。

称取10 g 荔枝空白基质，比较了不同提取溶剂用量 (10、15、20、25 mL) 对各目标农药提取回收率的影响 (图1)。结果表明，随着提取剂体积增加，目标农药回收率不断提升，当提取剂含量达到20 mL 时，各目标农药回收率超过60%。考虑提取体积过大，会造成试剂浪费及降低目标农药的灵敏度，选择在10 g 样品中添加20 mL乙腈。

图1 不同提取体积对回收率的影响Fig.1 Influence of different extraction volume on recovery rate

2.2.2 净化剂优化 在荔枝空白基质中添加0.02 mg/kg 的目标农药，加入20 mL 乙腈提取，加入EN.15662 萃取缓冲体系QuEChERS 盐包分层后，取2 mL 上清液，分别添加各2.5 mg/mL GCB 和NH2-MWCNTs 填料，考察对样品净化效果及农药回收率的影响。结果 (图2) 发现：GCB对噻菌灵、氯吡脲、灭幼脲和噻苯隆等农药的吸附性较强，农药回收率低于60%，而MWCNTs对各目标农药的回收率均大于60%，因此选择NH2-MWCNTs 为净化剂填料。

图2 不同净化剂对4 种农药回收率的影响Fig.2 Influence of different purification materials on recovery rate of 4 pesticides

进一步对NH2-MWCNTs 的用量进行了优化，将2 mL 提取液分别加入含有2、4、5、8 和10 mg NH2-MWCNTs 的净化管中，以回收率考察其净化效果。结果发现，所有目标农药的平均回收率均大于87%，且随着NH2-MWCNTs 用量的增加，样品中色泽亮度增大，但噻菌灵、噻苯隆、氯吡脲和灭幼脲等农药的平均回收率也随之降低 (图2)。因此确定NH2-MWCNTs 用量为2.5 mg/mL (2 mL 提取液中含5 mg NH2-MWCNTs)。

2.3 方法学评价

2.3.1 线性范围及定量限 分别向荔枝、龙眼和香蕉空白基质溶液中添加一定量的标准溶液，配制成质量浓度分别为0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.10 和0.20 mg/L 的基质标准工作溶液，以目标化合物质量浓度为横坐标，各化合物的定量离子对的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。方法定量限 (LOQ) 的评价以最低添加浓度且可准确定量为依据。结果表明，各农药在0.002～0.2 mg/L 范围内线性关系良好，决定系数 (R2) 均大于0.9902，LOQ 在0.005 ～ 0.05 mg/kg 之间。

2.3.2 正确度与精密度 分别向荔枝、龙眼和香蕉空白基质溶液中添加LOQ、2LOQ 和10LOQ 3 个水平的标准混合溶液，各农药的回收率在61%～120%，相对标准偏差0.30%～15% (表2)。表明该方法可用于荔枝、龙眼和香蕉中多农药残留的筛查和检测。

表2 110 种农药定量限、决定系数、添加平均回收率和相对标准偏差( n = 6)Table 2 Limit of quantification(LOQ), determination coefficients, the average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 110 pesticides ( n = 6)

2.3.3 基质效应 带有羧基、氨基、酰胺基、羟基等基团的农药易发生基质增强或抑制效应[27]，通常通过空白样品基质中标准曲线的斜率A 与溶剂中标准曲线的斜率B 评价基质效应 (ME)[28]，即：ME/% = (A-B)/B × 100。当ME ＜ 0，为基质抑制效应；ME ＞ 0，为基质增强效应；|ME| ＜ 20%，为弱基质效应；20% ≤ |ME| ≤ 50%，为中等基质效应；|ME| ＞ 50%，为强基质效应。

按照本实验建立的方法与GB 23200.121—2021《食品安全国家标准 植物源性食品中331 种农药及其代谢物残留量的测定》方法建立基质标准曲线，分别考察了荔枝、龙眼和香蕉3 种基质的基质效应。结果表明，荔枝、龙眼和香蕉中弱基质效应农药比例分别为50.9%、40%和61.8%，较GB 23200.121—2021 方法的弱基质效应农药比例分别增加28.2%、20.0%和16.4%；而强基质效应农药均下降至8.2% (表3)。因此，在定量分析中根据样品种类选择相应的空白基质，采用基质匹配标准曲线校正，降低基质效应。

表3 不同方法测定3 种基质的基质效应对应的农药数量Table 3 The number of pesticides within different matrix effect ranges in three matrices by different methods

2.4 实际样品检测

利用建立的检测方法，测定市售的39 份样品(包括14 份龙眼、10 份荔枝、15 份香蕉)。结果发现：在28 份样品中检出农药残留，检出农药19 种，检出农药以杀虫剂和杀菌剂为主，单个样品检出农药种类1～8 种。检出频率较高的农药有：吡唑醚菌酯 (22 份)、多菌灵 (15 份)、吡虫啉(9 份)、联苯菊酯 (5 份)、霜霉威 (4 份)。

对检测结果进行分析发现，有22 份样品检出吡唑醚菌酯，包括荔枝8 份，最大残留值为0.084 mg/kg，低于我国食品安全国家标准[23](0.1 mg/kg)；香蕉8 份，最大残留值为0.10 mg/kg；龙眼6 份，最大残留值为0.12 mg/kg，均符合食品安全国家标准要求。15 份样品检出多菌灵，其中龙眼7 份，最大残留值为0.33 mg/kg，远低于食品安全国家标准要求 (10 mg/kg)；荔枝和香蕉分别为4 份，最大残留值分别为0.30、0.20 mg/kg，符合食品安全国家标准要求 (荔枝0.5 mg/kg、香蕉2 mg/kg)。在香蕉中有4 份样品检出吡虫啉，最大残留值为0.024 mg/kg，符合食品安全国家标准要求 (香蕉0.05 mg/kg)，荔枝和龙眼中也有检出，分别为2 份和3 份，最大残留值分别为0.052、0.024 mg/kg，但我国尚未制定最大残留限量值 (其中，日本规定在其他水果中残留限量值为4 mg/kg[29])。荔枝中联苯菊酯和霜霉威的残留量分别为0.20～0.24 mg/kg和0.039～0.30 mg/kg，而我国尚未制定其最大残留限量值。目前，日本规定在其他水果中残留限量值为0.3 mg/kg[29]，未查询到霜霉威在荔枝、龙眼、香蕉中的最大残留限量值。

3 结论

本研究基于QuEChERS 前处理技术结合LCMS/MS 建立了同时检测热带水果中110 种农药的分析方法，采用增加提取溶剂乙腈的体积，消除糖析现象，选择和优化了NH2-MWCNTs 为净化材料的用量，确定15 mg 的NH2-MWCNTs 与900 mg MgSO4、150 mg PSA 结合的QuEChERS基质分散净化剂对热带水果荔枝、龙眼、香蕉进行有效的净化，与现有标准方法比较，本研究建立的方法能够有效的降低基质效应，提高了准确性，为热带特色水果中多农药残留检测及确证分析提供技术支持。