氯虫苯甲酰胺与杀虫单复配处理水稻种子对稻纵卷叶螟的防效及持效机理

于居龙, 张 国, 张新凤, 朱阿秀, 张海波, 万 群,程金金, 张建华, 姚克兵, 束兆林*,

(1.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏 句容 212400；2.江苏省植物保护植物检疫站，南京 210036；3.江苏省农业科学院 农业资源与环境研究所，南京 210014)

稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是我国水稻上最重要的迁飞性害虫之一，主要以幼虫啃食叶片，缀叶成纵苞，影响水稻光合作用，从而影响水稻产量[1-2]。目前对稻纵卷叶螟的防治仍以化学农药茎叶喷雾为主[3]，常用药剂有甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、茚虫威、氯虫苯甲酰胺、四氯虫酰胺、阿维菌素及其复配药剂等[4]。

农药被植物的茎、叶、根和种子吸收而进入植物体内，并在植物体内传导扩散，以使分布至植株各部位的药量足以保护植物免受伤害，此即为农药的内吸作用[5]。常见内吸性杀虫药剂有新烟碱类、双酰胺类及三氟苯嘧啶、螺虫乙酯、吡蚜酮、杀虫单、杀虫双等[6-8]。利用内吸性药剂进行水稻种子处理，可达到省工省药、对非靶标生物安全的目的。唐涛等[9]研究发现，30%噻虫嗪种子处理悬浮剂能有效控制稻蓟马为害，播后23～30 d 卷尖率远低于空白对照，大幅度减轻了稻蓟马对水稻叶片的危害。在江苏省丘陵稻区，采用10% 三氟苯嘧啶悬浮剂按1.5～6 g/kg (种子，以下同) 的剂量对水稻进行干籽拌种或者先浸种后拌种的方式处理，可有效降低直播稻和机插秧田间稻飞虱种群数量，且对水稻安全，对天敌蜘蛛影响较小[10-11]。邓理楠等[12]的研究表明，双酰胺类杀虫剂拌种处理对鳞翅目害虫具有一定的防治效果，采用10%氟虫双酰胺 • 阿维菌素悬浮剂按15～30 g/kg 的剂量拌种处理，对二化螟具有较好的控制效果。此外，唐涛等[13]利用24%氟虫双酰胺水分散粒剂按1～4 g/kg (种子)剂量拌种处理，播种后64 d 对稻纵卷叶螟的防效仍在63.19%～77.27%之间。韩永强等[14]等采用50%氯虫苯甲酰胺悬浮剂按1.25 g/kg 的剂量拌种防治二化螟和稻纵卷叶螟，直播田播种后62 d 内的螟害株率和卷叶株率均显著低于喷雾对照，对二化螟的防效在93%以上，对稻纵卷叶螟的防效在70%以上，同时还能促进水稻生长，具有一定的增产效应。

氯虫苯甲酰胺属于双酰胺类杀虫剂，主要作用于靶标害虫的鱼尼丁受体，导致其细胞内钙离子的过度释放，从而引起肌肉调节衰弱或麻痹，直至害虫死亡[15]。现有研究表明，水稻种子经过氯虫苯甲酰胺拌种处理后，在旱育秧、直播稻和机插秧模式下均可长效控制田间稻纵卷叶螟，持效期可达90 d 以上[16-18]。杀虫单是我国自主研发合成的杀虫剂，属于沙蚕毒素的类似物，是乙酰胆碱竞争性抑制剂，具有较强的触杀、胃毒和内吸传导作用，速效性好，对鳞翅目害虫有较高的防效，但在作物上的持效期较短[19-20]。

鉴于氯虫苯甲酰胺和杀虫单分别具有长效和速效性，同时均有优异的内吸传导性，故开展了以氯虫苯甲酰胺和杀虫单作为主要成分的复配增效研究，制备成氯虫 • 杀虫单种子处理悬浮剂 (FS)，并结合田间试验研究了该复配药剂种子处理对水稻的安全性及对靶标害虫的控制能力，测定了氯虫苯甲酰胺和杀虫单在植株内的残留及消解动态，以期为防治稻纵卷叶螟复配种子处理药剂的开发和害虫长效防控提供理论依据及技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试药剂及试剂

98%氯虫苯甲酰胺 (chlorantraniliprole) 原药，湖北玖丰化工有限公司；98%杀虫单 (monosultap)原药，江苏溧化集团公司。对照药剂20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂 (SC)，美国富美实公司；90%杀虫单可湿性粉剂 (WP)，安徽华星化工有限公司。25%氯虫 • 杀虫单种子处理悬浮剂 (FS，分别含10%氯虫苯甲酰胺和15%杀虫单，所用成膜剂和着色剂等均为常规农药助剂，不会对田间试验造成影响)，委托江苏擎宇化工科技有限公司制备。

氯虫苯甲酰和杀虫单标准品，纯度均≥98%，由江苏省农产品质量检验测试中心提供。乙腈为色谱纯；甲酸和乙酸铵纯度≥98%。

1.2 主要仪器

Agilent 1290 超高效液相色谱仪 (UPLC)，安捷伦科技 (中国) 有限公司；ABsciex 4500 质谱检测器，上海爱博才思分析仪器贸易有限公司；XP105DR型电子天平 (精确到0.001 g)，赛多利斯科学仪器有限公司；AWL-020I-P 超纯水系统，艾科浦仪器有限公司；H2050R 型医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 供试昆虫

稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis幼虫于2021 年采自江苏省句容市水稻田，室内参照朱阿秀等[21]的方法，采用小麦苗饲养5 代以上。

1.4 试验方法

1.4.1 内吸活性测定 参考NY/T 1154.4—2006《农药室内生物测定试验准则 杀虫剂 第4 部分：内吸活性试验 连续浸液法》推荐的方法并加以改进。准确称取氯虫苯甲酰胺原药0.0102 g，用100 mLN,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 充分溶解，配成100 mg/L的氯虫苯甲酰胺-DMF 母液；称取杀虫单原药0.1020 g，用1000 mL 超纯水溶解，配制成100 mg/L的杀虫单母液。

将上述2 种药剂母液分别按氯虫苯甲酰胺 :杀虫单 (质量浓度比) 为1 : 0、0 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3、2 : 3、3 : 2、3 : 1 和2 : 1 的比例进行复配，用超纯水稀释成6～7 个浓度梯度药液进行试验。将在培养箱中种植15 d 的麦苗拔出洗净，根部浸没至上述试验药液中24 h，用清水漂洗干净后剪去根部，再用吸水后的脱脂棉将麦苗基部包裹，放入一次性塑料培养皿中，每个培养皿中挑入20 头左右1～2 龄的稻纵卷叶螟幼虫，保鲜膜扎孔覆盖后放入25 ℃ ± 2 ℃的光照培养箱中培养。每个试验处理重复3 次，以清水处理为对照。于接虫后48 h 调查各培养皿中稻纵卷叶螟幼虫生存状态，以毛笔尖轻触虫体无反应为死亡。分别记录活虫数和死亡虫数，计算存活率、毒力回归方程，按照公式 (1)～(3) 计算复配剂的共毒系数。

式中：ATI 为混剂的实测毒力指数，LC50(sr)为标准药剂的LC50值，LC50(tr)为供试药剂的LC50值；TTI 为混剂的理论毒力指数，ATIa为药剂a 的实测毒力指数，Pa为药剂a 在混剂中的百分含量，ATIb为药剂b 的实测毒力指数，Pb为药剂b 在混剂中的百分含量；CTC 为共毒系数。

通过内吸活性测定，选择其中共毒系数最高的氯虫苯甲酰胺和杀虫单配比，委托江苏擎宇化工科技有限公司制备成氯虫 • 杀虫单种子处理悬浮剂 (FS) 样品。

1.4.2 田间试验 田间试验安排在江苏丘陵地区镇江农业科学研究所农业科技创新中心院内进行，试验田块土壤类型为板浆白土。供试水稻品种为上农软香18，用种量为60 kg/hm2，水稻种子先用清水浸种48 h，沥干12 h 后拌种。田间试验共设置7 个处理，具体见表1，以未进行任何处理的裸种为空白对照。其中药剂对照组 (处理5 和处理6) 在拌种时均同样添加与处理1～4 相同的成膜剂和着色剂，用量均为1 g/kg (种子，其余同)。成膜剂可提高药剂在种子上的附着率，而着色剂主要起指示作用，预试验表明，成膜剂和着色剂单独使用对田间最终防效无影响。

表1 田间试验各处理药剂及用量Table 1 Pesticides and dosages used in the field assay

各处理拌种后平铺阴干，播种于硬质秧盘(60 cm × 30 cm × 3.2 cm) 中，每1 kg 种子播种6 个秧盘，常规育秧25 d 后移栽。每个处理设3 次重复，随机区组排列，每个小区面积不小于100 m2，小区之间用双泥埂隔开并单独排灌，避免田水串流。

共调查4 次田间稻纵卷叶螟发生情况，田间防效调查时间分别为播种后第56 天、第67 天、第82 天和第94 天。每个小区调查50 穴水稻，记录每穴水稻的叶片数、白叶数，其中白叶以剑叶及倒2 叶出现虫苞或遭幼虫啃食出现新鲜白斑为标准。按公式 (4)～(5) 计算白叶率和保叶效果。

式中：R为田间白叶率；Nw为调查的总白叶数；Nt为调查的总叶片数。E为保叶效果；Rb为对照区田间白叶率；Rt为处理区田间白叶率。

1.4.3 取样方法 室内内吸活性试验于播种后第15 天取秧盘上的水稻叶片，田间试验分别于播种后第56 天、第67 天、第82 天和第94 天取田间各小区水稻植株剑叶或倒2 叶叶片。每处理取3 份重复样品，经前处理后进行药剂含量检测。

1.5 水稻种子发芽及出苗试验

水稻种子发芽率及出苗率分别按照前文报道的方法[16]进行测定。发芽率测定：每处理取100粒种子，放入已铺有充分润湿吸水纸的培养皿中，置于培养箱35 ℃条件下培养24 h，后调整温度为25 ℃，培养至第7 天时记录种子发芽数。出苗率测定：每处理取100 粒种子，置于吸足水分的育秧基质上，覆盖0.5 cm 左右薄土，置于温室大棚中，模拟正常育秧情况进行培养，至第15 天时调查各处理出苗数。设置未处理裸种空白对照。每处理重复3 次，分别计算发芽率及出苗率。

1.6 药剂残留含量检测方法

1.6.1 样品前处理 将水稻叶片洗净后，用吸水纸擦干表面水分，放至牛皮纸袋中，置于40 ℃烘箱中烘干6 h，利用高速粉碎机研磨粉碎后备用。

样品中氯虫苯甲酰胺的提取净化：准确称取1 g 粉碎后的水稻叶片样品于50 mL 离心管中，加入20 mL 60%的乙腈溶液，旋转提取30 min 后，于4000 r/min 下离心2 min；取上清液5 mL，置于依次加有C18(75 mg) 和PSA (100 mg) 的10 mL离心管中，涡旋混匀30 s，于4000 r/min 下离心5 min；取上清液过0.22 μm 滤膜，待测。

样品中杀虫单的提取净化：准确称取1 g 粉碎后的水稻叶片样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 60% 的乙腈溶液，室温下涡旋提取40 min；于4000 r/min 下离心2 min，取上清液过0.22 μm 滤膜，待测。

1.6.2 氯虫苯甲酰胺检测方法 液相色谱条件：Agilent C18色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，进样量1 μL。流动相A 为0.1%的甲酸，B 为99.9%的乙腈，流速0.2 mL/min。梯度洗脱程序为：0～1 min，50% A；＞1～4.5 min，50%～10% A；＞4.5～6 min，10% A；＞6～6.1 min，10%～50% A；＞6.1～10 min，50% A。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，MRM 多反应监测模式。气帘气压力241.32 kPa，电喷雾电压5500 V，离子源温度450 ℃，雾化气压力275.79 kPa，加热器压力275.79 kPa，去簇电压80 kV。定量离子对 (m/z) 484.1/286.0，碰撞能20 kV；定性离子对 (m/z) 484.1/453.0，碰撞能25 kV。

1.6.3 杀虫单检测方法 液相色谱条件：Kinetex Hilic 色谱柱 (100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，进样量1 μL。流动相A 为5 mmol/L 乙酸铵水溶液，B 为99.9%的乙腈，流速0.2 mL/min。梯度洗脱程序为：0～0.5 min，10% A；＞0.5～2 min，10%～90% A；＞2～3.5 min，90% A；＞3.5～3.51 min，90%～10% A；＞3.51～5 min，10% A。

质谱条件：电喷雾离子源，负离子扫描，MRM多反应监测模式。气帘气压力241.32 kPa；电喷雾电压-4500 V；离子源温度450 ℃；雾化气压力275.79 kPa，加热器压力275.79 kPa，去簇电压-60 kV。定量离子对 (m/z) -310.0/-184.9，碰撞能-30 kV；定性离子对 (m/z) -310.0/-230，碰撞能-20 kV。

1.7 数据处理

利用 Microsoft Excel 2010 与DPS 7.05 软件进行数据处理，以单因素ANOVA 的 Duncan 氏新复极差法对各处理的发芽率、出苗率、白叶率、保叶效果、杀虫效果及药剂含量进行差异显著性检验。所有数据处理均未经转换。

2 结果与分析

2.1 氯虫苯甲酰胺与杀虫单复配的内吸活性

结果 (表2) 表明：氯虫苯甲酰胺和杀虫单单剂浸液处理对稻纵卷叶螟1～2 龄幼虫的LC50值分别为0.74 和13.29 mg/L，均表现出一定的内吸杀虫活性。将氯虫苯甲酰胺和杀虫单按不同质量浓度比进行混配后，共毒系数在105.49～174.43 之间，均表现出一定的复配增效作用，其中以氯虫苯甲酰胺 : 杀虫单为2 : 3 时共毒系数最高，增效作用最为明显。

表2 氯虫苯甲酰胺与杀虫单复配对稻纵卷叶螟的内吸杀虫活性Table 2 Systemic insecticidal activity of chlorantraniliprole and monosultap combination against Cnaphalocrocis medinalis

2.2 药剂种子处理对水稻发芽及出苗的影响

结果 (图1) 表明，试验剂量下，25%氯虫 •杀虫单FS 拌种处理对水稻种子发芽和出苗均安全。处理后7 d，空白对照及各药剂处理组水稻种子发芽率在86.00%～89.00%之间，处理组与对照组之间均无显著性差异；25%氯虫 • 杀虫单FS 不同剂量拌种处理后水稻种子发芽率在86.00%～88.67%之间，不同剂量之间也均无显著性差异(P≥0.05)。处理后15 d，空白对照及各处理组出苗率在83.67%～86.33%之间，相互间也均无显著性差异 (P≥ 0.05)。

图1 药剂处理水稻种子对发芽及出苗的影响Fig.1 The effect of pesticide treated seeds on the germination and seedling emergence in rice

2.3 氯虫苯甲酰胺和杀虫单在水稻植株中的含量变化

2.3.1 苗期水稻植株中药剂含量变化 水稻拌种处理后15 d，2 种单剂处理组水稻植株中均可检测到一定含量的氯虫苯甲酰胺或杀虫单，而25%氯虫 • 杀虫单FS 复配剂各剂量处理组水稻植株内可检测出高含量的氯虫苯甲酰胺残留，且其含量与药剂用量呈正相关，但杀虫单的含量较低且各处理之间无显著性差异 (图2)。其中，采用7.5 g/kg剂量的20%氯虫苯甲酰胺SC 单剂拌种处理15 d后，水稻植株中氯虫苯甲酰胺的残留量为4989.67 μg/kg，显著低于相同有效药量的25%氯虫 • 杀虫单FS 复配剂15 g/kg 剂量处理，与氯虫苯甲酰胺有效用量减少三分之一的复配剂10 g/kg 剂量处理之间无显著性差异。说明与20%氯虫苯甲酰胺SC单剂相比，所制备的复配剂25%氯虫 • 杀虫单FS 可显著提高苗期水稻植株对氯虫苯甲酰胺的吸收量。

图2 单剂及不同剂量复配剂拌种后15 d 水稻植株中药剂含量变化Fig.2 Change of pesticide content in rice plant 15 days after seed dressing with single agent and compound agents

2.3.2 田间水稻叶片中氯虫苯甲酰胺含量变化

检测结果表明，随时间延长，各处理水稻植株中氯虫苯甲酰胺均表现为持续消解状态 (图3)。在一定剂量范围内，水稻叶片中氯虫苯甲酰胺含量随拌种药剂有效药量的增加而增加，其中25%氯虫 •杀虫单FS 复配剂用量为12.5～15 g/kg (氯虫苯甲酰胺有效药量为1.25～1.5 g/kg) 时，叶片中氯虫苯甲酰胺含量较高，高于有效药量1.5 g/kg 的氯虫苯甲酰胺SC 单剂拌种处理，而25%氯虫 • 杀虫单 FS 复配剂10 g/kg (氯虫苯甲酰胺有效药量为1.0 g/kg)剂量拌种与有效药量1.5 g/kg 的氯虫苯甲酰胺单剂拌种相比无显著性差异，表明氯虫苯甲酰胺与杀虫单复配可增强水稻种子对氯虫苯甲酰胺的吸收，从而提高叶片中氯虫苯甲酰胺的含量。

图3 单剂及不同剂量复配剂拌种后水稻叶片中氯虫苯甲酰胺含量变化Fig.3 Change of chlorantraniliprole content in rice leaves after seed dressing with single agent and compound agents

2.3.3 田间水稻叶片中杀虫单含量变化 检测结果表明，杀虫单作为种子处理药剂拌种后，在水稻叶片中含量整体极低，且含量与药剂用量之间无明显相关性 (图4)。

图4 单剂及不同剂量复配剂拌种后水稻叶片中杀虫单含量变化Fig.4 Change of monosultap content in rice leaves after seed dressing with single agent and compound agents

2.4 药剂拌种处理对田间稻纵卷叶螟的防治效果

田间调查结果 (表3) 表明，不同剂量25%氯虫 • 杀虫单FS 复配剂拌种对田间稻纵卷叶螟均有一定的防治效果，而90%杀虫单WP 拌种对后期稻纵卷叶螟基本无效。除拌种处理后82 d，25%氯虫 • 杀虫单FS 10 和12.5 g/kg 剂量组保叶效果显著高于20% 氯虫苯甲酰胺SC 单剂处理 (P＜0.05) 外，其余情况下，FS 复配剂不同剂量之间以及与20%氯虫苯甲酰胺SC 之间均无显著性差异(P≥0.05)。拌种后94 d，25%氯虫 • 杀虫单FS 复配剂按7.5～15 g/kg 的用量进行拌种处理，防治效果与氯虫苯甲酰胺单剂处理相当。总体而言，利用杀虫单与氯虫苯甲酰胺进行复配拌种，在减少氯虫苯甲酰胺用量的情况下，不会影响对田间稻纵卷叶螟的防治效果。

表3 单剂及不同剂量复配剂拌种处理后不同时间对田间水稻的保叶效果Table 3 Leaf protection effects of single and compound agents coated seeds on field rice at different time intervals

3 结论与讨论

稻纵卷叶螟是水稻上重要的迁飞性害虫，目前防治措施仍以化学药剂茎叶喷雾防治为主，防治策略提倡治早、治小，建议在害虫卵孵盛期或幼虫低龄期用药[22]，但在实际生产防治过程中，由于田间稻纵卷叶螟世代重叠严重，田间种群复杂，农户无法完全掌握卵孵盛期或低龄虫期，导致防治适期延误或防效不理想。本团队前期研究表明，利用氯虫苯甲酰胺拌种处理，对机插秧、手栽稻或直播稻上的稻纵卷叶螟具有85%以上的防治效果，有效防治时长可超过90 d[16-18]。

氯虫苯甲酰胺是目前防治稻纵卷叶螟的主流药剂，但常年使用已导致部分地区靶标害虫对其产生了一定程度的抗药性[3,23]。杀虫单是一种高效、低毒、低残留的沙蚕毒素系仿生类杀虫剂，对鳞翅目害虫有很好的防治效果，但由于连续使用了几十年，害虫抗药性也已逐渐提高[24-25]。氯虫苯甲酰胺和杀虫单均具有自下而上的内吸活性[26-27]，均具有作为种子处理药剂使用的潜力，因此将两者进行复配是发挥各自药剂特性最有效方法。室内内吸活性测定结果表明，氯虫苯甲酰胺和杀虫单按质量浓度比2 : 3 复配时具有较高的共毒系数，对稻纵卷叶螟低龄幼虫活性最高，按照该比例制备成的25% 氯虫 • 杀虫单FS (其中分别含10%氯虫苯甲酰胺和15%杀虫单) 在7.5～15 g/kg(种子) 制剂用量范围内拌种处理，不会影响水稻种子发芽和出苗。

杨听雨等[28]研究表明，拌种15 d 后，有0.43%的氯虫苯甲酰胺分布于水稻的根和茎中，另有60.17%分布于种壳和育苗土中，而该部分农药可进一步通过水稻根系的吸收作用，持续向水稻植株的茎叶部迁移，因此本研究中在水稻苗期也检测出了较高含量的氯虫苯甲酰胺。随着拌种后时间延长，田间水稻叶片中杀虫单含量极低，基本失去控制靶标害虫的作用，而氯虫苯甲酰胺却能持续维持一定的高含量，田间对稻纵卷叶螟也表现出较好的控制效果，因此叶片中的氯虫苯甲酰胺残留是长效控制稻纵卷叶螟的主要原因。本研究中，与同等用量的氯虫苯甲酰胺单剂相比，无论是对苗期还是田间水稻而言，25%氯虫 • 杀虫单FS 复配剂拌种处理组水稻植株或叶片中氯虫苯甲酰胺的含量均高于单剂处理，表明复配药剂可促进水稻根部对氯虫苯甲酰胺的吸收。药剂之间复配增效的原因可能是一种药剂的添加增强并诱导了植株对另一种药剂的吸收能力[29-31]，至于氯虫苯甲酰胺与杀虫单复配的具体增效机制还需进一步研究。

25%氯虫•杀虫单FS 作为种子处理药剂，其中有效成分氯虫苯甲酰胺和杀虫单主要通过土壤吸附和植株内吸传导进入环境。前人研究表明，在田间开放系统中，氯虫苯甲酰胺在土壤中的半衰期为6.6～16 d，不同地区存在差异，但总体而言氯虫苯甲酰胺属于易降解性农药[32-33]。杀虫单与氯虫苯甲酰胺类似，在土壤中半衰期较短，也属于易降解性农药。同时机插水稻一般在秧盘上育秧20～30 d 后才移栽大田，因此拌种处理药剂被携带进入田间的量也会显著减少，再加上田间长期流水环境及高温高湿条件，推测田间土壤中残留的药剂浓度不会太高，对生态环境影响不大，但鉴于氯虫苯甲酰胺具有较强的内吸性和土壤吸附性，使用时仍应避免田水流入桑田和鱼池等，同时后续还将对土壤中药剂的累积残留和对非靶标生物的安全性进行进一步研究。中国规定氯虫苯甲酰胺和杀虫单在糙米中的最大允许残留限量(MRL)值分别为0.5 mg/kg 和0.2 mg/kg。水稻种子采用25%氯虫 • 杀虫单FS 拌种处理后，历经整个生育期，至水稻成熟时杀虫单基本无残留；前期研究表明，每1 kg 水稻种子利用高达10 g 的20%氯虫苯甲酰胺SC 处理后，最终收获的稻谷中均未检出氯虫苯甲酰胺残留[16]。因此采用25%氯虫•杀虫单FS 处理水稻种子，对收获期的稻谷基本无药剂最终残留风险。

综合水稻叶片中药剂含量检测与田间防效测定结果表明，25%氯虫 • 杀虫单FS 复配剂对田间稻纵卷叶螟具有较好的防治效果，对水稻种子发芽和出苗安全，每1 kg 种子采用7.5～15 g 复配药剂进行拌种处理，对田间稻纵卷叶螟具有较好的控制作用，播种后94 d 仍有70% 左右的保叶效果，其持效性主要与叶片中残留的氯虫苯甲酰胺含量有关，杀虫单在其中所起的作用主要是提高苗期水稻根部对氯虫苯甲酰胺的吸收率。