牛呼吸道合胞体病毒一步法实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

梁晓珊，宁鹏，李小龙，鲍显伟，李昊，石亚楠，王雪妍，郭雪莲，许立华

(宁夏大学动物科技学院，宁夏 银川 750021)

牛呼吸道合胞体病(bovine respiratory syncytial disease，BRSD)是由牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)引起的一种呼吸道传染病，是牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)的主要疾病之一[1]。BRSV主要通过空气飞沫传播，可感染牛、羊等多种反刍动物，其中2～6月龄犊牛的发病率高，但单独感染后死亡率较低[2-3]。牛感染BRSV后，可继发细菌感染，出现严重间质性肺炎、上呼吸道感染等多种严重临床症状，引起泌乳奶牛产奶量下降或废绝、妊娠母牛流产和犊牛死亡。已有研究发现BRSV影响牛气管上皮细胞对多杀性巴氏杆菌的黏附作用，使病原侵入下呼吸道后发生更为严重的继发感染[4-5]。BRSD传染性强，在全球范围内流行，增加奶牛及肉牛养殖、治疗成本，严重影响我国畜牧业经济稳定发展。

BRSV的荧光定量PCR检测方法靶基因多为N基因及部分F基因，而随着病毒的传播变异，这些检测技术具有一定的局限性[6-8]。近期，郭兵等[8]根据BRSV的F基因建立TB Green Ⅱ 荧光定量PCR检测方法，该方法特异性良好且最低检测限达39 copies/μL。常益铭等[9]根据N基因建立恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法，该方法敏感性高，最低检测限为3.45 copies/μL。上述的检测方法可为BRSV的检测提供新的技术支撑，但在检测中，反转录过程中反复开盖容易造成污染，影响结果的准确性。

综上，本研究基于BRSV M基因保守序列，建立检测BRSV的一步法实时荧光定量PCR，并初步应用于牧场临床样品检测，旨在为宁夏地区BRSD的流行病学调查提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 核酸及临床样品

BRSV阳性样品，牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛支原体、牛冠状病毒、牛细小病毒、金黄色葡萄球菌、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛源肠球菌等病原的核酸样品均由本实验室保存。94份临床样品采自宁夏各规模化牧场。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒(Kit R6874)、琼脂糖胶回收试剂盒(Kit D2500)购自广州飞扬生物工程有限公司；逆转录试剂盒(6210A)、pMD18-T(6011)等购自宝生物工程(大连)有限公司；2 ×TaqPlus Master Mix(P211)、HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit(Q223)购自诺唯赞生物科技股份有限公司；氨苄青霉素、琼脂糖购自大连美仑生物技术有限公司；LB液体培养基、LB固体培养基购自生工生物工程有限公司；5 × Prestained Loading Dye、Prestained DL2000 DNA Marke 购自礼美生物科技(上海)有限公司；50 × TAE缓冲液购自北京雷根生物技术有限公司；DH5α、质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

M. DL-2000 Marker；1. pMD18-T-BRSV-重组质粒。

1.3 试验方法

1.3.1 引物及探针设计与合成

基于 GenBank数据库中BRSV现有病毒基因组序列，使用MAFFT对序列进行比对，选择BRSV M蛋白基因保守区域，使用NCBI Primer designing Tool 引物设计工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计BRSV通用型引物及探针(表1)。其中，TaqMan探针使用5′-FAM、BHQ1-3′修饰，扩增后的目的片段大小为141 bp。引物及探针交由生工生物工程有限公司合成。

表1 BRSV引物、探针序列信息

1.3.2 标准质粒构建

使用BRSV-F、BRSV-R对BRSV的cDNA进行扩增及胶回收后，与pMD18-T在16 ℃条件下进行过夜连接，并转化至DH5α，获得重组质粒pMD18-T-BRSV。经测序验证正确后使用质粒小提试剂盒进行质粒提取，使用NanoDrop One测质粒浓度后分装至于-80 ℃ 冰箱保存。

1.3.3 反应条件优化

基于HiScript II U+One Step qRT-PCR Probe Kit的推荐体系，以107copies/μL的pMD18-T-BRSV标准质粒为模板。使用梯度温度法对反应体系的温度进行优化，其中，梯度温度分别为58 ℃、57.4 ℃、56.2 ℃、54 ℃、51.3 ℃、49.2 ℃、47.7 ℃、47 ℃等8种；使用棋盘法对引物及探针浓度进行优化，其中引物的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9 μmol/L，探针浓度设计为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40和0.45 μmol/L，确定该引物探针最佳扩增条件。

1.3.4 标准曲线的建立

以102～109copies/μL 重组质粒为模板，每个稀释度的标准质粒使用1.3.3中优化后的最佳条件进行3次重复检测，绘制该检测方的标准曲线。

1.3.5 敏感性检测

选取浓度为100～109copies/μL 10个不同的浓度pMD18-T-BRSV重组质粒为模板，对检测方法的敏感性进行验证。

1.3.6 特异性检测

采用1.3.1设计的引物探针及优化后的反应条件对IBRV、牛支原体、牛冠状病毒、牛细小病毒、金黄色葡萄球菌、BVDV、牛源肠球菌、BRSV等8种病原的核酸进行扩增，以ddH2O为阴性对照，以107copies/μL标准质粒为阳性对照；采用优化后的最优反应条件进行该方法的特异性验证。

1.3.7 重复性检测

将pMD18-T-BRSV重组质粒进行10倍倍比稀释，选取105、106和107copies/μL的pMD18-T-BRSV重组质粒为模板，对该检测方法的组内重复性及组间重复性进行验证，使用变异系数评估该检测方法的重复性。

1.4 临床样品检测

对收集到的94份血清样品，使用病毒RNA提取试剂盒提取核酸后进行检测，并使用魏硕佟等[10]建立的BRSV单一PCR检测方法进行检测，比较两种检测方法的检测结果，评估建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR检测方法在实际生产应用中的可行性。

2 结果与分析

2.1 重组质粒标准品的构建

以BRSV 核酸为模板，逆转录后使用表1中引物BRSV-F、BRSV-R 进行 PCR扩增，扩增产物经电泳纯化回收后与pMD18-T载体连接，构建重组质粒标准品。以pMD18-T-BRSV重组质粒为模板，使用BRSV特异性引物BRSV-F、BRSV-R对质粒pMD18-T-BRSV-F进行扩增，扩增产物大小为141 bp，与预期目的片段大小一致，结果见图1。

2.2 BRSV荧光定量PCR检测方法的反应条件优化

2.2.1 温度优化

使用58 ℃、57.4 ℃、56.2 ℃、54 ℃、51.3 ℃、49.2 ℃、47.7 ℃、47 ℃ 8种不同温度对扩增反应的退火温度进行优化，试验结果表明，该反应体系最优扩增条件为：55 ℃ 15 min逆转录；95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 10 s、54 ℃ 30 s，共40个循环。

2.2.2 引物及探针浓度优化

采用棋盘法对扩增体系中的引物及探针浓度进行优化，试验结果表明，该引物及探针的最优反应体系(20 μL)：2 × One Step U+Mix 10 μL，One Step U+Enzyme Mix 1 μL，ddH2O 5.8 μL，上下游引物各0.4 μL，探针0.4 μL，模板RNA 2 μL。

2.3 标准曲线的建立

使用优化后的最佳反应条件，以102～109copies/μL 8种浓度的重组质粒为模板进行扩增，每个浓度的模板进行3个重复；扩增后对Ct值求取平均值后结合模板质粒浓度绘制标准曲线；根据扩增结果及模板拷贝数绘制的标准曲线为y=-0.299 8x+11.724，R2=0.997 4，斜率k=-0.299 8，表明该标准曲线线性关系良好(见图2)。

图2 pMD18-T-BRSV荧光定量PCR标准曲线

2.4 敏感性试验

采用优化后的反应体系及扩增条件，以100～109copies/μL 10个不同的浓度pMD18-T-BRSV重组质粒为模板进行扩增。试验结果表明，该反应体系阴性对照无扩增，检测下限为10 copies/μL(图3)。

N. ddH2O；1～10. pMD18-T-BRSV质粒浓度分别为109，108，107，106，105，104，103，102，10和1 copies/μL。

2.5 特异性试验

使用表1的引物及探针对IBRV、牛支原体、牛冠状病毒、牛细小病毒、金黄色葡萄球菌、BVDV、牛源肠球菌、BRSV 8种病原的核酸进行扩增。试验结果表明，除阳性对照及BRSV核酸正常扩增外，阴性对照及其他病原无扩增(图4)，即检测方法可与其他呼吸道病原进行鉴别，表明该方法特异性较好。

S. pMD18-T-BRSV标准质粒；N. ddH2O；1. BRSV；2. IBRV；3. 牛支原体；4. 牛冠状病毒；5. 牛细小病毒；6. 金黄色葡萄球菌；7. BVDV；8. 牛源肠球菌。

2.6 重复性试验

使用最优体系及最佳扩增条件对105、106和107copies/μL的pMD18-T-BRSV重组质粒为模板，对该检测方法的组内重复性及组间重复性进行验证。结果如表2所示，该检测方法的组内及组间的变异系数均小于2%，表明方法的重复性较好。

表2 实时荧光定量PCR组内及组间重复性试验

2.7 临床样品检测

用本研究建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR检测方法，对取自宁夏不同牧场的94份血清样本进行检测，同时使用魏硕佟等[10]建立的BRSV普通PCR检测方法检测，结果如表3所示。BRSV一步法实时荧光定量PCR方法检出阳性样品5份，检出率为5.3%；普通PCR方法检出0份。说明本研究建立的方法比普通PCR方法能更灵敏地检测到BRSV。

表3 实时荧光定量PCR组内及组间重复性试验结果

3 讨论

近年来，我国多地区存在BRSV的流行，严重困扰养牛业的健康发展。魏硕佟等[10]发现宁夏地区BRSV阳性率为15.05%；姜利霞等[11]发现湖南省BRSV阳性率为0.84%；赵毅等[12]发现东北三省BRSV感染率为32.75%。预防BRSD及其他呼吸道传染病的主要措施是加强饲养管理和疫苗接种。疫苗接种虽然取得了较好的防控效果，但目前依然存在局限性，影响疫苗的整体免疫效果[13]。因此对该病的主动高效检测及监测，对BRSD的防控有重要意义。

荧光定量PCR技术已被应用于多种疾病的检测诊断。研究人员已采用SYBR Green Ⅰ染料法和TaqMan探针基于N基因建立多种针对BRSV的检测方法，如孙晓波等[14]基于SYBR Green Ⅰ染料法建立N基因荧光定量PCR；韦佳塔等[15]与齐力格尔等[16]建立N基因荧光探针PCR检测方法。在荧光定量PCR检测中，探针和引物的选择对检测方法建立至关重要，对检测灵敏度和准确性影响很大[17]。本研究以BRSV M蛋白为靶标基因，设计特异性引物探针，通过对优化反应条件、引物和探针浓度等多种条件进行优化，选取最适引物探针浓度及反应条件，建立一步法实时荧光定量PCR。

本研究建立的BRSV一步法荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点，检测下限可以达到 10 copies/μL，且可有效减少反复开盖导致的交叉污染。此外，该检测方法重复性好，组内及组间的变异系数均小于2%。对本实验室2023年第一季度收集的94份血清样本进行检测，发现BRSV阳性率为5.3%，提示BRSD在宁夏地区存在一定的流行，该检测结果对了解宁夏地区BRSD的流行病学信息具有一定意义。

综上，在今后的疫病监测工作中，应加强对包括BRSD在内的牛呼吸道疾病的检测与监测，防范BRSD在我国发生大范围流行。此外，要进一步加强BRSV的致病机制研究，为研发有效疫苗以防范BRSD发生大规模流行提供理论支撑。