禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

方天，李乔斌，冯孝傲，朱二鹏，2，陈常秀，程振涛，2*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省动物疾病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)属于腺病毒科、禽腺病毒属[1]。根据群特异性抗原特征将禽腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群和12个血清型，又根据系统进化树、基因组分为A～E 5个基因型[2]。安卡拉病毒属于I群禽腺病毒血清4型(fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)，基因型为C型，感染鸡后其特征性病变为心包积液-肝炎综合征(Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)[3]，病理变化是黄色心包积液、肿胀，肝脏坏死、有点状出血，其对家禽业造成了巨大经济损失[4-5]。HHS最初于1987年报道在巴基斯坦卡拉奇发生，在1年内迅速传播到巴基斯坦其他地区，随后在南美洲和亚洲暴发，包括伊拉克、日本、智利、韩国和中国[6]。该病多发于3～5周龄的肉鸡，死亡率在30%～70%之间，最高可达80%，且死亡率随着鸡日龄的增大而降低，成年蛋鸡死亡率一般不超过10%，发病鸡群产蛋率下降10%～30%[7]。开展对HHS的诊断、预防和治疗研究是防控本病的必要手段，基于FAdV-4病毒结构蛋白的诊断方法、新型疫苗开发、抗体类分子制剂等研究多建立于目的蛋白的分子特征分析、蛋白表达与纯化、抗体制备的基础上，是防控HHS的技术关键。五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)是FAdV-4主要结构蛋白之一，Penton对病毒粒子在细胞中的装配和维持病毒粒子的结构和病毒侵入细胞方面发挥作用，在不同血清型间较为保守[8]；Fiber1能够直接与宿主细胞受体结合，可介导病毒内化，在病毒感染细胞时绑定细胞，影响病毒的致病性，Fiber1蛋白与Penton base相连伸出[9]。目前对FAdV-4主要结构蛋白的研究较多，但并无针对相关蛋白的成熟商品化疫苗推出，对FAdV-4主要结构蛋白的致病机理、免疫效果的探索仍是当下研究的主题。

本试验基于FAdV-4结构蛋白Penton和Fiber1分子特征分析，选择N端优势抗原表位基因片段进行原核表达，获取纯化蛋白并制备其多克隆抗体，最后对多克隆抗体效价、重组蛋白的免疫原性和反应原性作出评价，可为FAdV-4结构蛋白生物学功能研究、诊断试剂盒研发以及临床药物治疗提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物、菌种、载体和质粒

6～8周龄BALB/c小鼠购自贵州医科大学实验动物中心；pCold Ⅰ载体、DH5α感受态细胞、BL21(DE3)感受态细胞均购自上海碧云天生物技术有限公司；pMD19-T-Penton克隆载体、pMD19-T-Fiber1克隆载体由贵州大学预防兽医学实验室保存。

1.1.2 主要试剂

酵母粉、胰蛋白胨购自OXOID公司；2×TaqPCR Master Mix、T4连接酶、HindⅢ、BamHⅠ、pMD-19T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；E.Z.N.A.®Plasmid kit 质粒提取试剂盒购自Omega BIO-TEK公司；蛋白纯化试剂盒、山羊抗小鼠IgG HRP、His小鼠单抗、聚丙烯酰胺凝胶试剂盒、5×SDS蛋白上样缓冲液均购于上海碧云天生物技术有限公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自 Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Penton和Fiber1蛋白生物信息学分析

应用在线软件ProtParam分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白的基本理化性质；应用在线软件DETAIBIO分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白信号肽和跨膜区；应用DNAStar软件包Protean分析Penton、Fiber1蛋白B细胞抗原表位的亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原指数；应用软件SOPMA与SWISSMODEL分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白二级结构与三级结构。

1.2.2 FAdV-4 Penton和Fiber1基因表达载体构建

1.2.2.1 引物设计

根据GenBank数据库中已发表的FAdV基因序列(登录号：GU188428)，应用Primer Pemier 5.0软件设计合成两对引物，分别扩增Penton和Fiber1，命名为pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1，引物序列见表1，预期扩增片段大小分别为717 bp和366 bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.2.2 目的基因扩增、克隆与阳性重组质粒筛选

使用质粒DNA提取试剂盒从保存的菌液中提取pMD19-T-Penton克隆载体、pMD19-T-Fiber1克隆载体质粒DNA，以各自的质粒DNA为模板，按以下反应扩增：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃终延伸10 min。扩增结束后PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。使用胶回收试剂盒切胶回收目的基因，将回收产物与pColdⅠ空载体分别应用对应的内切酶37 ℃酶切过夜，回收酶切过的目的片段并与pColdⅠ使用T4连接酶4 ℃连接过夜。将连接产物转化入DH5α感受态细胞，后置于LB固体培养基培养16 h，挑取单个菌落接种含Amp的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒并进行PCR与双酶切鉴定，将阳性质粒送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

1.2.3 Penton和Fiber1重组蛋白的原核表达

1.2.3.1 蛋白表达形式验证

将测序鉴定成功的阳性重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞培养过夜，扩大培养后加入IPTG至终浓度1.0 mmol/L，37 ℃振荡培养4 h，诱导表达目的蛋白，取菌液离心后将PBS洗涤冻融后的沉淀超声波裂解，分别收集上清液和沉淀，上清液需要咪唑洗脱液进行洗脱，沉淀则需要咪唑脲素(50 mmol/L)洗脱，取适量样品用12% SDS-PAGE分析其蛋白表达形式。

1.2.3.2 Penton和Fiber1重组蛋白纯化

采用结合His-tag标签的蛋白纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE分析与Western blot鉴定，将细菌裂解液、上样穿流液、洗涤液、洗脱液制样后进行SDS-PAGE分析。

SDS-PAGE参考步骤如下：组装制胶模具并参照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配置浓缩胶，待浓缩胶凝固后配置分离胶并转移在玻璃夹层内，将裂解的蛋白混合蛋白上样缓冲液后在沸水中放置10 min后，每泳道20 μL上样量于孔中，将SDS-PAGE缓冲液倒入电泳槽中，在样品进入分离胶之前80 V恒压，之后100 V恒压直跑到凝胶底部。从胶板中取出凝胶，置于染色容器内，加入考马斯亮蓝染色液，染色30 min。倒掉染色液后并用去离子水清洗后，并加入100 mL脱色液脱色至背景清晰。

Western blot参考步骤如下：经SDS-PAGE后按照胶块大小裁剪PVDF膜，安装好转印夹后放入垂直电泳槽中，加入适量转膜缓冲液100 mA恒流转印3 h，结束后取出PVDF膜使用5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加入适当比例稀释的His小鼠单抗37 ℃摇床孵育1 h，加入HRP标记山羊抗鼠IgG HRP酶标二抗37 ℃摇床孵育1 h，中间使用TBST洗涤，最后用DAB底物显色溶液对PVDF膜显色，红外扫描仪扫描PVDF膜观察结果。

1.2.4 Penton、Fiber1蛋白多克隆抗体制备

1.2.4.1 动物免疫与血清收集

采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的蛋白进行蛋白浓度测定，按免疫剂量为200 μg/只免疫小鼠。将制备的重组蛋白与弗氏佐剂等体积混匀，采用皮下注射免疫。第1次免疫14 d后进行第2次免疫，7 d后进行第3次免疫；3次免疫后对小鼠进行眼球采血，离心后收集血清。

1.2.4.2 多克隆抗体Western blot鉴定与ELISA抗体效价测定

将纯化重组蛋白Penton、Fiber1分别进行SDS-PAGE，分别使用制备的Penton和Fiber1多克隆抗体进行Western blot分析，在印迹试验中将一抗换成Penton、Fiber1多克隆抗体，HRP标记的山羊抗小鼠IgG作为二抗，试验步骤同1.2.3.2。

应用ELISA方法对血清抗体进行效价测定，将酶标板放入酶标仪里面，在OD450进行读数，根据吸光值来判断多克隆抗体的效价。ELISA试剂盒具体操作步骤如下：将纯化好的蛋白用包被液来稀释成10 μg/mL，在酶标板上每孔加入100 μL，4 ℃孵育过夜。倒掉酶标孔中的液体，然后使用洗涤液(1×PBST)洗涤5次，每次3 min，最后1次在吸水纸上拍干。加入封闭液每孔200 μL，37 ℃孵育2 h。再次洗涤，加入稀释好的待测血清100 μL，转移到37 ℃恒温培养箱1 h。继续洗涤后加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000倍稀释)每孔100 μL，37 ℃孵育1 h。再洗涤，最后加入显色液A 和显色液B 各50 μL，混匀，避光显色10 min，最后加50 μL终止液终止反应。结果判定：以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性；P/N值小于2.1，但大于或等于1.5为可疑；P/N值小于1.5为阴性。

2 结果

2.1 目的蛋白的生物信息学分析

应用生物分析软件分析FAdV-4 Penton、Fiber1蛋白的基本理化性质，信号肽，跨膜区，B细胞抗原表位的亲水性、柔韧性、表面可及性、抗原指数(图1)，二级结构及三级结构。由表2可知，FAdV-4Penton基因完整开放阅读框为1 578 bp，共编码525个氨基酸，理论等电点(pI)为5.03，总平均亲水性(GRAVY)为-0.300，推测该蛋白为酸性亲水蛋白(pI<7，判定酸性；pI>7，判定碱性)(GRAVY负值的绝对值越大，亲水性越高)，不稳定系数(II)为46.30(II>40，不稳定；II<40，稳定)推测该蛋白为不稳定蛋白。FAdV-4Fiber1基因完整开放阅读框为1 299 bp，编码432个氨基酸，pI为4.77，GRAVY为-0.120，推测该蛋白为酸性亲水蛋白；II为35.89，推测该蛋白为稳定蛋白。软件分析结果显示，Penton和Fiber1蛋白均无跨膜区，进行原核表达时不用考虑将跨膜区去除；均无信号肽，不能分泌到胞外。

FAdV-4 Penton蛋白二级结构中α-螺旋占比15.4%，β-转角占比7.43%，无规则卷曲和延长链占比77.17%，无β-折叠；在5～23、65～76、163～171、216～227、366～375、 452～462、486～490肽段共有7个B细胞表位，且该连续线性表位均位于肽段的无规卷曲和延长链处，很可能是FAdV-4 Penton的优势抗原表位区域。由图1B可知，FAdV-4 Fiber1蛋白二级结构中α-螺旋占比6.48%，β-转角占比6.25%，无规则卷曲和延长链占比87.27%，无β-折叠；在15～24、32～49、223～230、302～309、327～332、352～358肽段共有6个B细胞表位，且该连续线性表位同样位于肽段的无规卷曲和延长链处，很可能是FAdV-4 Fiber1的优势抗原表位区域。FAdV-4 Penton和Fiber1蛋白都是以无规则卷曲和延长链为主，α-螺旋和β-转角为辅。无规则卷曲和转角散在存在，提高了目的蛋白充分与周围的极性环境相接触，为抗原表位的形成提供了有利条件。

2.2 Penton、Fiber1基因表达载体构建

2.2.1 目的基因PCR扩增

以pMD19-T-Penton克隆载体、pMD19-T-Fiber1克隆载体为模板，扩增Penton、Fiber1基因目的片段。由图2和图3可见，PCR能扩增出与预期目的基因大小相符的特异性目的片段条带。

M. DL2000分子质量标准；1～5. 质粒pMD19-T-Penton；6. 阴性对照。

M. DL2000分子质量标准；1～4. 质粒pMD19-T-Fiber1；5. 阴性对照。

2.2.2 阳性重组质粒PCR鉴定

将重组质粒pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1使用所设引物与反应条件进行PCR扩增。由图4和图5可见，能扩增出与预期目的基因大小相符的片段。

M. DL2000分子质量标准；1. 阳性对照；2～5. 重组质粒pColdⅠ-P；6. 阴性对照。

M. DL2000分子质量标准；1. 阳性对照；2. 重组质粒pColdⅠ-F1；3. 阴性对照。

2.2.3 重组质粒双酶切鉴定

分别对pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组质粒使用两组限制性内切酶(BamHⅠ与HindⅢ、HindⅢ与XbaⅠ)进行酶切鉴定。由图6和图7所示，均出现双酶切条带，重组质粒pColdⅠ-P、pColdⅠ-F1目的条带分别717 bp、366 bp。阳性重组质粒经测序验证，与预期相符，说明重组原核表达质粒构建成功。

M. DL5000分子质量标准；1～3. 重组质粒；4. 空载体对照。

M. DL5000分子质量标准；1～2. 重组质粒；3. 空载体对照。

2.3 Penton和Fiber1重组蛋白的原核表达

2.3.1 重组蛋白表达形式验证

将离心收集的蛋白样品取20 μL使用SDS-PAGE分析其蛋白表达形式。由图8和图9可见，重组菌pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1在沉淀中表达，表明Penton蛋白和Fiber1蛋白主要为包涵体表达。

M. 180 kDa预染蛋白；1. pColdⅠ-P诱导沉淀；2. pColdⅠ-P诱导上清液。

M. 180 kDa预染蛋白；1. pColdⅠ-F1诱导沉淀；2. pColdⅠ-F1诱导上清液。

2.3.2 重组蛋白纯化与鉴定

将纯化后的目的蛋白使用SDS-PAGE和Western blot检测。由图10和图11可见，重组蛋白Penton、Fiber1纯化后电泳分别出现31.8 kDa、16.5 kDa的蛋白条带，无杂蛋白条带，说明均已成功纯化。由图12和图13可知，Western blot印迹目的条带分别为31.8 kDa、16.5 kDa，与预期相符，说明所纯化得到的蛋白为带有His标签的目的蛋白。

M. 120 kDa预染蛋白；1. 上样穿流液；2～3. 洗涤液(0.2 mmol/L咪唑脲素)；4～8. 洗脱液(50 mmol/L咪唑脲素)

M. 120 kDa彩色预染蛋白；1. 上样穿流液；2～3. 洗涤液(0.2 mmol/L咪唑脲素)；4～7. 洗脱液(50 mmol/L咪唑脲素)。

1. 阴性对照；2.带His标签的重组蛋白Penton。

1. 阴性对照；2. 带His标签的重组蛋白Fiber1。

2.4 Penton、Fiber1蛋白多克隆抗体效价测定及Western blot鉴定

2.4.1 重组蛋白浓度测定

采用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的蛋白进行浓度测定，用酶标仪测定OD630处的吸光值，根据测定样品的吸光值推算出重组蛋白Penton和Fiber1蛋白浓度分别为3.371 μg/μL和1.235 μg/μL。

2.4.2 多克隆抗体Western blot鉴定

以重组蛋白Penton和Fiber1作为抗原进行Western blot鉴定。由图14和图15所见，重组蛋白Penton制备的多克隆抗体能够特异性识别31.8 kDa条带，重组蛋白Fiber1制备的多克隆抗体能够特异性识别16.5 kDa条带，与预期结果相符。

1. 阴性对照；2. Penton蛋白。

2.4.3 多克隆抗体效价测定

应用ELISA方法对小鼠血清抗体进行效价测定，结果如表3、表4所示，Penton多克隆抗体的效价在1∶3 200以上，而 Fiber1多克隆抗体的效价在1∶1 600倍稀释时为阳性，稀释至1∶3 200时P/N值为可疑，重组蛋白Penton的血清抗体效价大于Fiber1。说明重组蛋白Penton较Fiber1具有更高的免疫原性。

表4 重组蛋白Fiber1多克隆抗体效价检测

3 讨论

基因序列的生物信息学分析有助于了解编码蛋白的结构与成分，为目的蛋白的体外表达、应用等奠定基础。通过生物信息学分析，明确蛋白理化性质、抗原表位，可为亚单位疫苗、抗体制备提供有效的数据基础[10]。本研究使用生物信息学分析预测出Penton蛋白的亲水性能力大于Fiber1蛋白，更有利于将其以可溶性蛋白形式表达。有研究分析了FAdV-4主要结构蛋白的二级结构、三级结构，并预测了各蛋白潜在的B细胞、CTL细胞、Th细胞抗原表位[11]。因蛋白结构与氨基酸组成不同，FAdV-4 Penton蛋白优势抗原表位点区域分布较为均匀，含有FAdV-4的主要抗原表位和中和抗体的识别表位，该蛋白免疫鸡后可诱导有效的免疫保护，证实该蛋白可用于亚单位疫苗的研制及单克隆抗体的制备[12]。研究发现，Penton抗体可以阻断病毒体从酸性的核内质进入细胞浆，从而使病毒感染性失活，因此Penton蛋白的高效表达对诊断试剂、抗病毒药物及疫苗的制备研究等都具有重要意义[13]。Fiber1在氨基酸N端拥有最高的抗原性、柔韧性、亲水性和表面可及性，相关研究将携带Fiber1、Fiber2突变基因的腺病毒质粒转染鸡LMH细胞，Fiber1突变的重组病毒无法拯救，而Fiber2组则成功拯救，证实Fiber1对介导病毒吸附至关重要，而该区域可能是病毒粒子与细胞膜上受体结合的位点[14]。本研究通过原核表达载体pColdⅠ实现FAdV-4 Penton、Fiber1重组蛋白大量表达，可为后续动物免疫提供优势抗原，但表达的Penton、Fiber1重组蛋白均为包涵体表达，与杨华、罗思思等[15-16]试验结果一致。有研究将Penton基因全序列克隆至pCold-SUMO表达载体中，成功高效表达出可溶性Penton蛋白，关于Penton、Fiber1重组蛋白亲水性对比需进一步验证。

多克隆抗体在病原的检测和疾病治疗上具有重要价值[17]。以FAdV-4全病毒灭活抗原为诊断抗原存在易散毒、制备繁琐、成本高等缺点，而使用原核表达系统表达出的人工抗原易于纯化与标准化，成本低且无散毒风险[18]。研究FAdV-4衣壳蛋白多克隆抗体可为后续FAdV-4检测方法的开发及其相关致病机制的研究奠定物质基础[19]。本研究应用ELISA方法对制备的鼠源Penton、Fiber1多克隆抗体进行了效价测定，Penton多克隆抗体在1∶3 200倍稀释时仍有很高的免疫原性，而Fiber1多克隆抗体效价仅为1∶1 600，说明重组蛋白Penton比Fiber1具有更高的免疫原性，可作为制备亚单位疫苗的优势抗原。

综上所述，本研究对Penton和Fiber1基因优势抗原片段序列进行扩增并克隆至pColdⅠ表达载体，成功在大肠杆菌中获得了高效表达，通过免疫小鼠后测定其血清抗体效价，证实Penton重组蛋白具有良好的免疫原性，为后续亚单位疫苗或单克隆抗体研发奠定了基础。