基于感官组学分析鉴定无花果提取物关键特征风味物质

王新惠，何 峰，李瑞丽，王翰书，梁 淼，张逸寒，潘文亮,，张峻松,

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；2.河北中烟工业有限责任公司技术中心，河北 石家庄 050051）

无花果为桑科榕属植物，富含蛋白质、多酚、维生素、膳食纤维等，不仅营养丰富、味道甘甜，同时具有润肺、改善脾胃、治疗咽喉肿痛等药用价值，是优质的食疗保健性水果[1-2]。作为一种香味原料，无花果常以浸膏、精油、酊剂等形式存在于食品、日化等领域。目前国内外有关无花果的研究主要集中在有效成分提取工艺的优化[3-5]、挥发性成分的提取分析方法及应用[6-8]、相关制品感官品质的影响因素等方面[9-11]。如研究人员利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术鉴定无花果超临界提取物中的19 种化合物，发现主要成分有长链有机酸、香豆素和苯丙烷类化合物[7]。邓星星等[11]采用GC-MS、电子鼻及感官评价，检测出无花果及其果酒的挥发性成分分别为28 种和21 种，共有成分8 种，自制果酒不仅保留了无花果的挥发性成分，且有新的挥发性成分产生。

目前无花果的研究主要围绕药理、保鲜技术、成分分析等[12]，无花果提取物作为天然香原料，其组成成分较为复杂，关于无花果提取物香气活性化合物鲜有报道。为鉴定特征香气成分，气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术、香气活性值（odour activity value，OAV）及香气重组缺失等是找出关键特征风味成分的重要方法。如蔡莉莉等[13]以感官为导向，通过GC-MS分析确定了葫芦巴内酯和香兰素为3 种市售枫槭浸膏烤甜香的关键致香成分。刘子豪等[14]利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）、GC-O等分析鉴定得知菇娘果特征香气成分为2-甲基丁酸甲酯、甲硫基丙醛和己醛。李瑞丽等[15]通过HS-SPME-GC-MS分析香荚兰提取物挥发性香气成分，利用嗅觉阈值、OAV及香气重组实验明确了香兰素、愈创木酚、乙酸等14 种化合物为香荚兰特征风味物质。因此，本研究通过HS-SPME-GCMS对无花果提取物进行成分分析，结合GC-O、OAV确定对无花果提取物具有重要贡献的特征风味物质，并通过香气重组和缺失实验明确无花果提取物关键特征风味物质。旨在为无花果特征风味天然香原料的开发及质量控制提供理论基础，也为无花果相关产品的风味品质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无花果购于云南昆明新泰商贸有限公司。

无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司；乙酸苯酯（98%）、乙酸（99.5%）、异丁酸（99%）、羟基丙酮（98%）、2,3-丁二醇（98%）、糠醛（99%）、糠醇（标准品）、2-乙酰基呋喃（98%）、5-甲基糠醛（99%）、苯甲醛（98%）、吡咯-2-甲醛（98%）、甲基环戊烯醇酮（99%）、苯甲醇（≥98%）、γ-己内酯（98%）、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（98%）、芳樟醇（标准品）、反式-2-壬烯醛（97%）、2-乙酰基吡咯（98%）、2-丙酰呋喃（97%）、癸醛（标准品）、DL-苹果酸二乙酯（98%）、5-羟甲基糠醛（98%）、香兰素（99%）、香叶基丙酮（标准品）、邻苯二甲酸二甲酯（98%）、二氢猕猴桃内酯（标准品）、棕榈酸乙酯（97%）、油酸乙酯（标准品）、正构烷烃 北京百灵威科技有限公司；壬醛（96%）、2,3-二氢-3,5-二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮（95%）、亚麻酸乙酯（≥98%）上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B GC-MS联用仪（配有ODP-2嗅觉检测器端口）美国Agilent公司；手动SPME进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；PEN 3.5型便携式电子鼻传感器 德国Airsense公司；B13-3智能恒温定时磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；EL-204电子天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；HZ-2电热恒温水浴锅 北京市医疗设备总厂；DLSB-10/25低温冷却液循环泵 郑州凯鹏实验仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHB-3循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 无花果提取物的制备

采用热风干燥法制备无花果干，取无花果干果片为原料，打碎成粉，采用80%乙醇溶液以料液比为1∶5进行热浸提，回流提取3 h后，减压过滤除去滤渣，减压旋蒸除去乙醇，得到无花果浸膏[16]。

1.3.2 HS-SPME前处理

参考黄贵元等[17]的方法，并稍作修改。将萃取头在气相色谱进样口于250 ℃老化10 min。取0.5 g无花果提取物和1 μL 0.2 μg/μL的乙酸苯酯置于40 mL顶空瓶中，加盖密封，60 ℃平衡30 min，然后在持续加热和搅拌（200 r/min）条件下，插入萃取头，吸附50 min后，立即取出萃取头并插入GC进样口，250 ℃解吸3 min。

1.3.3 GC-MS条件和GC-O分析

GC条件：HP-5MS色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 μm，0.25 μm）；载气：He气；恒流模式2.0 mL/min；升温程序：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min速率升至180 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；不分流进样；进样口温度250 ℃；传输线温度280 ℃。

MS条件：离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电离电压：70 eV；传输线温度：280 ℃；质量扫描范围m/z30～550[17]。

定性定量分析：根据NIST17质谱库检索、标准品保留时间、保留指数、香气描述对香气化合物进行定性，采用内标法建立各化合物的标准曲线，对OAV＞1的化合物进行定量分析[18]。

GC-O分析：采用检测频率（detection frequency，DF）法，由8 位实验人员对经色谱柱分离出的物质进行嗅闻，统计每种物质的出现频率，记录出现的次数，记为DF值，并筛选频率大于50%的成分为关键风味物质进行分析[19]。

1.3.4 OAV测定

OAV为各化合物在提取物中的质量浓度与嗅觉阈值的比值；OAV＞1，表示该物质对总体香气有贡献，一般来说，OAV越大表示该物质对总体的香气贡献越大[20]。

1.3.5 无花果提取物及香气重组样品感官评价

经DF法和OAV分析筛选出对无花果提取物整体风味有重要贡献的物质（OAV＞1），按其利用内标标准曲线法在提取物中测定的实际浓度进行香气重组。

参照GB/T 10220—2012《感官分析方法学总论》[21]，组织8 位专业人员组成感官评价小组（评价小组人员均具有良好的气味感知能力和感官评价经验），对无花果提取物样品及重组样品的香气轮廓进行定量描述性感官分析。实验在25 ℃室温条件下进行，依据评价标准（表1），对样品进行香气评价，采用十分制。结果取8 位感官评价员打分的平均值。

表1 嗅香评价标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of aromas

1.3.6 香气缺失实验

为深入评价OAV＞1香气活性化合物的贡献，参考文献[22]进行香气缺失实验。缺失模型即从重组样品中对其中一组化合物或单个化合物进行缺失，共设计16 个缺失模型。采用3 点检验[23]进行评价，为评价人员提供2 个重组模型和1 个缺失模型，所有的样品随机编码，要求评价人员在每组样品中选择差异较大的样品，确定缺失模型和重组模型之间差异的显著性。

1.3.7 电子鼻分析条件

精确称量0.1 g样品，加入40 mL吹扫捕集瓶中，拧紧瓶盖，于室温放置20 min后开始用电子鼻检测。传感器清洗时间为120 s；归零时间为5 s；样品准备时间为5 s；样品采集时间为60 s，载气为洁净空气，载气和样品气体流量均为400 mL/min，每个样品重复测定3 次。PEN 3.5型电子鼻由10 个加热型金属氧化物传感器阵列、气体流量控制系统及分析控制软件组成，10 根传感器描述如表2所示[17]。

表2 PEN3.5 电子鼻传感器敏感物质Table 2 Performance description of PEN3.5 electronic nose sensors

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC-MS结合GC-O鉴定无花果提取物特征风味物质

利用HS-SPME-GC-MS分析无花果提取物，共鉴定出挥发性香气成分40 种，主要包括酸类4 种、醇类3 种、酯类12 种、醛类7 种、酮类4 种、呋喃类8 种、其他类2 种。评价人员通过GC-O共感知到31 种，结果如表3所示。赵巨堂等[16]采用HS-SPME-GC-MS法对无花果浸膏进行香气成分分析，发现其主要香气成分有芳樟醇氧化物、糠醛、苯甲醇、高级脂肪酸等化合物，且含量较高，这可能是对无花果提取物特征风味有重要贡献的香气化合物。

酯类化合物是一类重要的香气活性化合物，大多具有水果香气，可赋予无花果提取物果香、花香和甜香。γ-内酯类化合物是果香的重要香气物质[24]，广泛存在于水果、葡萄酒、奶制品等多种食品[25-26]。其中γ-丁内酯具有微弱的好闻的淡奶油芳香，γ-己内酯具有椰香、甜香，一些高级脂肪酸乙酯，如棕榈酸乙酯、亚麻酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯等，均具有微弱的脂香味和奶油香。其中，γ-己内酯DF值最高（DF＝7），γ-丁内酯（DF＝4）、棕榈酸乙酯（DF＝5）具有较高的DF值，这些化合物对无花果提取物的整体香气轮廓具有重要贡献。

呋喃类是无花果提取物中另一类重要的香气活性化合物，其种类和含量均较高。其中糠醛、5-甲基糠醛、5-羟甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮的检测频率较高（DF≥4），且这些化合物均具有甜香、焦糖及焙烤特征香气。有研究报道[27]，含糖丰富的食品在热加工过程中会产生大量的糠醛和5-羟甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮等焦糖香物质，表明焦糖香物质的形成均与糖类物质有关，无花果是一种含糖量丰富的果实，因此，在无花果提取物中检测到这类物质含量较多。

醛类化合物中苯甲醛（DF＝6）具有苦杏仁、坚果香，在香精香料中常用来配制花香香精；壬醛（DF＝4）具有油脂气息，可为果汁等产品贡献花香和果香；反式-2-壬烯醛（DF＝4）具有花香和果香；香兰素（DF＝5）具有奶香、花香，共同构成了无花果提取物丰富的果香、甜香、烘焙香等特征香气[27]。酸类化合物主要呈酸香，其存在可以使风味更加饱满，可为无花果提取物提供酸香香韵，如异丁酸（DF＝5）。

醇类是一类阈值较高的挥发性化合物，主要是多不饱和脂肪酸在一系列酶的作用下发生脂质氧化的产物[28]。其中苯甲醇（DF＝5）具有微弱的芳香、花香和果香，芳樟醇的DF值最高（DF＝7），香气较为复杂，兼有花香、果香和木香[29]，共同赋予了无花果提取物花香、果香气息，对无花果提取物的整体香气轮廓具有重要贡献。

酮类化合物大多被认为呈脂香和焦香，且随着碳链的增长呈现较强的花香气息[30]，酮类物质主要由脂肪氧化、酯类分解或糖类热解反应形成[31]。如甲基环戊烯醇酮（DF＝6）具有焦糖、坚果香气，为无花果提取物的特征风味做出重要贡献。

2.2 无花果提取物特征风味物质OAV分析结果

OAV是挥发性成分含量与其在食物中检测阈值的比值，能够反映某个香气化合物对整体香气的贡献程度，OAV在0.1～1.0内表明化合物具有修饰整体风味的作用，大于1.0表明该化合物是关键风味物质，可影响样品整体风味，且OAV越大表示对样品的整体风味贡献越大。由表4可知，鉴定出18 种香气化合物的OAV大于1。组成无花果提取物的特征风味物质中包括酯类8 种、醇类3 种、呋喃类8 种、醛类6 种、酮类3 种、酸类2 种、杂环类1 种。其中酯类、醇类、呋喃类的含量较高，分别占总量的20.94%、18.87%、44.87%。

内酯类化合物对样品整体风味的形成具有重要作用，如γ-己内酯在芒果、杏、桃等多种水果的香气中具有重要贡献作用[32-36]；二氢猕猴桃内酯具有甜香、果香气息[37]；棕榈酸乙酯具有奶油香；苯甲醇和芳樟醇具有果香和花香；5-羟甲基糠醛、甲基环戊烯醇酮和4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮具有焦糖香、烘烤香，这些物质的OAV均大于100，表明这些物质对无花果提取物的风味贡献均较大。其次是苯甲醛、壬醛、香兰素、糠醛、糠醇、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、二氢猕猴桃内酯，这些物质的OAV相对较大，同时对风味轮廓的形成起重要作用。其中，香兰素的含量不高（20.31 mg/kg），但因其阈值低（0.578 mg/kg）而被鉴定为特征风味物质，类似的物质有壬醛。除此之外，部分化合物的含量较高，但由于阈值高得到的OAV小于1，如乙酸（900 mg/kg）、2-乙酰基吡咯（170 mg/kg）、2,3-丁二醇（1000 mg/kg），说明化合物的含量高低并不能代表对样品整体风味的贡献强弱，由此推测这些物质对无花果提取物风味轮廓的形成影响较小。

2.3 香气重组与缺失实验

为进一步证实无花果提取物中的特征香气化合物，将OAV＞1的18 种物质进行香气重组与缺失实验。由图1可知，重组样品与无花果提取物香气属性相比较，果香、焦糖香、烘焙香等香韵较无花果提取物的得分稍高，重组样品与无花果提取物的香气轮廓相似，表明重组样品成功地模拟了无花果提取物的整体风味特征。

图1 重组样品及无花果提取物的嗅香香气轮廓图Fig.1 Aroma profile of recombined samples and fig extract

为深入评价OAV＞1香气活性化合物的贡献，设计了16 个缺失模型，对其中一组化合物或单个化合物进行缺失。如表5所示，所有的评价人员能够识别出缺乏所有酯类物质的模型（模型1），且具有非常高的显著性，说明酯类化合物表现出的果香、甜香在无花果提取物的整体特征风味中发挥了重要作用。除γ-丁内酯、二氢猕猴桃内酯外（OAV＞200）的所有酯（模型1-3）缺失时，与重组模型无显著差异（P＞0.05），因此，说明γ-丁内酯、二氢猕猴桃内酯对整体风味作用不明显。进一步对γ-己内酯（模型1-1）、棕榈酸乙酯（模型1-2）分别建立缺失模型，发现γ-己内酯的缺失与重组模型具有极显著差异（P＜0.01），棕榈酸乙酯缺失时与重组模型相比具有显著差异（P＜0.05），说明γ-己内酯和棕榈酸乙酯对整体风味具有重要作用。对醇类物质分别做缺失实验，发现芳樟醇（模型2-1）和苯甲醇（模型2-2）的缺失与重组模型相比差异显著（P＜0.05），可知芳樟醇和苯甲醇具有的果香、甜香对无花果提取物整体香气具有重要作用。缺失所有醛类（模型3）时与重组模型相比具有极显著差异（P＜0.01）。当缺失苯甲醛（模型3-1）时与重组模型相比具有极显著差异（P＜0.01），缺失香兰素（模型3-2）时与重组模型相比差异显著（P＜0.05），可知这两种物质对整体风味形成具有一定的作用。缺失所有呋喃类化合物（模型4）时与重组模型相比具有高度显著差异（P＜0.001）。对OAV＞100的化合物分别进行缺失实验，发现缺失5-羟甲基糠醛（模型4-1）时与重组模型相比具有极显著差异（P＜0.01），缺失4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（模型4-2）时与重组模型相比具有显著差异（P＜0.05），进一步省略糠醛（模型4-3）时与重组模型相比差异不显著（P＞0.05）；此外，缺失除4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、糠醛的所有呋喃类物质（模型4-3和模型4-4）与重组模型相比无显著差异（P＞0.05），因此，说明4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛表现出的焦糖、烘焙香气对无花果提取物香气具有重要作用。缺失甲基环戊烯醇酮（模型5）时与重组模型相比具有显著差异（P＜0.05），说明甲基环戊烯醇酮对风味影响具有一定的作用。结果表明，γ-己内酯、棕榈酸乙酯、苯甲醇、芳樟醇、香兰素、苯甲醛、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、甲基环戊烯醇酮是无花果提取物特征风味的重要来源。

表5 无花果提取物完整重组样品的缺失实验Table 5 Results of omission experiments for complete recombinant samples of fig extract

2.4 电子鼻分析

电子鼻的10 个金属传感器能针对不同气体产生不同响应信号。对γ-己内酯、棕榈酸乙酯、苯甲醇、芳樟醇、香兰素、苯甲醛、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、甲基环戊烯醇酮按比例调配后的混合样品与无花果提取物进行电子鼻分析。图2为混合物与无花果提取物的电子鼻雷达图，可以看出，两者在W1W传感器的响应值最大，其次是W2W传感器，这与样品中具有类似萜烯结构香气成分、芳香类化合物有关[38]。另外两者在W1S、W2S、W5S均有响应，且差别不大。综合来看，无花果提取物相比于混配样品在10 个传感器的响应值整体偏低，两者的香气轮廓高度相似，表明混配样品能够很好地反映无花果提取物的香气特征。

图2 混配样品及无花果提取物的电子鼻数据雷达图Fig.2 Radar plot of electronic nose data for mixed samples and fig extract

3 结论

本研究利用HS-SPME-GC-MS、GC-O分析、DF法结合OAV、香气重组缺失实验对无花果提取物的香气成分进行分析。GC-MS与GC-O共鉴定出31 种化合物，结合OAV确定18 种重要风味物质。经重组实验验证，重组样品与无花果提取物的香气轮廓相似度高，呈现果香、甜香、烘焙香、焦糖香等典型的风味特征，略带酸香、膏香、奶香，具有明显的无花果提取物风味特征。采用缺失实验进一步明确无花果提取物关键特征风味物质，结果表明γ-己内酯、棕榈酸乙酯、苯甲醇、芳樟醇、香兰素、苯甲醛、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-羟甲基糠醛、甲基环戊烯醇酮为无花果提取物的关键特征风味物质。通过电子鼻对9 种关键特征风味物质的混配样品和无花果提取物进行对比分析，发现两者的香气轮廓具有高度相似性，表明混配样品能够很好地反映无花果提取物的香气特征。上述实验结果明确了无花果提取物的特征风味成分，可为无花果特征风味的香原料的开发及质量控制提供理论支撑，同时为无花果风味相关产品的研究提供参考。