人工窖泥微生物群落对浓香型白酒发酵过程风味代谢物形成的影响

毛凤娇，黄 均，周荣清,2, ，张宿义，秦 辉

（1.四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646699；3.四川省泸州市泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646699）

浓香型白酒的生产工艺特点之一是以内衬栖息多种厌氧微生物窖泥的长方形地下窖池为发酵容器[1]。窖泥微生物群落与窖龄和发酵过程参数的调控密切相关，显著影响发酵过程及白酒的品质和产率[2]。一般认为，许多重要风味化合物的形成与窖泥菌群的组成与演替息息相关[3-4]。应用可培和免培技术对窖泥的研究已经较清楚地了解了微生物群落的构成及功能，窖泥中的群落主要由细菌和真菌构成[5-6]。梭菌被认为是合成丁酸、己酸等中、短链脂肪酸的关键种群之一[7]。有研究表明，随着窖龄的增长，窖泥中的微生物多样性增加[3]，优质窖泥具有稳健的群落结构。这些研究主要集中在破译窖泥本身的微生物群落结构和组成方面。然而，迄今对窖泥栖息菌群的贡献缺乏科学的认识，目前尚不清楚窖泥微生物对风味化合物的贡献以及作用机制。本实验通过设置有泥和无泥组模拟发酵体系，解析酒醅间风味化合物的差异。同时，应用高通量测序技术检测酒醅中细菌和真菌的群落结构，探究风味化合物与微生物群落之间的相关性，以期阐明窖泥微生物群落对风味形成的影响规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所有试剂 成都金山化学试剂有限公司；2×Taq聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、ITS1/ITS4引物、DNase/RNase-free Deionized Water和真菌基因组DNA抽提试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

强化人工窖泥为实验室培养，质量分数5%的100 a窖泥培养液接种到1 a的新泥中，同时接种1%的太空大曲，室温厌氧发酵60 d[5]。太空大曲、高粱、糠壳和酒醅均取自中国四川省泸州市一家著名白酒企业，其中太空大曲通过接种1%的母曲生产，母曲是在神舟十一号飞船的太空舱中育种了1 个月的大曲粉经逐批扩大培养得到[8]。

1.2 仪器与设备

TGL 16M高速冷冻离心机 长沙湘麓离心机仪器公司；S100TMThermal Cycler PCR仪、Gel DocTMXR凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；ND-1000 NanoDrop分光光度计 美国赛默飞世尔科技公司；Infinite M1000 Pro全自动多功能酶标仪 瑞士Tecan有限公司；85-2型数显恒温磁力搅拌器 上海双捷实验设备有限公司；PHS3C pH计 上海大普仪器有限公司；1260高效液相色谱、Trace 1300-TQS 9000顶空固相微萃取-气相色谱-质谱美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 样品收集

使用5 L塑料容器（28 cm×19 cm×14 cm）作为实验室反应器模拟白酒发酵过程。设置窖泥组（JJP）和对照组（CJP）。窖泥组使用太空大曲和100 a窖泥培养液强化后的人工窖泥，厚度为4～4.5 cm，对照组中没有窖泥。按照DB510500/T 36—2016《单粮浓香型白酒原酒生产技术规范》操作工艺流程完成蒸粮，将上一轮发酵后的酒醅与高粱、糠壳按照20∶5∶1进行混合，蒸熟，冷却至40 ℃左右后添加20%（以体系质量计）的太空大曲混合均匀，待冷却到室温后，将上述发酵糟装入自制窖池中，用窖泥密封后置于培养箱内（26～28 ℃）厌氧发酵60 d[8]。在发酵的第15、30、45天和第60天分上下两层进行取样，对照组分别标记为U-CJP、B-CJP，实验组分别标记为U-JJP和B-JJP。

1.3.2 理化指标检测

总酸、总酯的检测方法分别参照GB/T 10345.4—1989《白酒中总酸的试验方法》、GB/T 10345.5—1989《白酒中总酯的试验方法》。水分质量分数通过质量法测定，在105 ℃下干燥至少4 h直至质量恒定。样品与超纯水按照1∶9（g/mL）混合，使用pH计直接测量pH值。通过蒸馏法及乙醇计测定乙醇体积分数。淀粉和还原糖的含量采用Fehling试剂法测定[9]。

1.3.3 有机酸分析

有机酸的测定采用高效液相色谱法，参照Chen Suqi等[10]描述的方法略作修改：称取5.0 g样品置于50 mL离心管中，用20 mL H2SO4溶液（0.009 mol/L）稀释，样品涡旋5 min（200 r/min），超声1 h（100 W、40 kHz）。经超声处理后的样品在12000 r/min（4 ℃）条件下离心10 min。取3 mL上清液加入活化后的C18SPE纯化柱，收集滤液，0.22 μm滤膜过滤，最后通过1260高效液相色谱分析。色谱条件：流动相为0.009 mol/L H2SO4溶液，流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL，柱温75 ℃。色谱柱为Alltech OA-1000有机酸柱（300 mm×7.8 mm），检测器为紫外检测器（波长210 nm）。用标准品乳酸、乙酸、丁酸和己酸等的浓度和峰面积绘制标准曲线对样品进行定性、定量分析。

1.3.4 挥发性代谢物分析

挥发性代谢物及含量：采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法，参考Zhang Liqiang等[11]的方法：将0.500 g样品和20 μL内标（0.0079 g/100 mL辛酸甲酯）加入20 mL顶空瓶中，置于60 ℃水浴锅中平衡15 min，使用固相微萃取头（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）萃取50 min，然后将其插入进样口解吸5 min，经质谱检测。

气相色谱-质谱条件：以20∶1分流模式进样，载气为纯度99.99%的氦气。升温程序：起始温度为40 ℃保持5 min，以4 ℃/min的速率升温至100 ℃，再以6 ℃/min的速率升温至230 ℃保持10 min。进样口温度为270 ℃，电子电离源，电子能量为70 eV，质量扫描范围m/z35～400。将挥发性代谢物数据与标准谱库（NIST 2017）对比进行鉴定，根据保留指数选取正反匹配度均大于800的物质给予分析[12]。基于内标辛酸甲酯浓度和峰面积对鉴定的挥发性化合物采用峰面积归一化法计算含量。

1.3.5 DNA提取和扩增子测序分析

按照Omega Mag-bind soil DNA试剂盒的操作说明提取DNA。1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop分光光度计检测DNA的浓度、纯度和完整性。使用引物338F和806R扩增16S rRNA基因的V3～V4区域，真菌以ITS1区域进行扩增[13]。利用建库试剂盒MiSeq ReagentKit v3进行文库构建，PCR扩增产物由琼脂糖凝胶切胶获得目标片段并纯化回收，酶标仪测定浓度后，等浓度混合。然后送往上海派森诺生物科技有限公司，利用Illumina MiSeq测序平台对DNA片段进行双端（Paired-end）测序。测序数据使用官方提供的QIIME 2（http://qiime.org）云平台分析[14]。根据Mothur软件（v1.31.2）的结果计算Shannon多样性指数和Chao1丰富度指数[15]。

1.4 数据处理与分析

样本平均值之间的差异显著性通过使用S P S S Statistics 22软件的单因素方差分析（ANOVA）进行检验，P＜0.05被认为具有统计学意义。采用Excel 2021和Origin 2021软件绘制数据并进行统计分析，结果以的形式表示。采用Chao1指数和Shannon指数评价微生物群落的α多样性。用Simca 14.0软件和pheatmap软件分别对挥发性代谢物进行偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA），并对PLS-DA的变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）进行评分和热图聚类分析。用R语言的hmisc软件包计算优势微生物（相对丰度＞1%）以及挥发性代谢物之间的Spearman相关系数（ρ）和显著性（P），并根据|ρ|＞0.6和P＜0.05构建共生网络，然后在Cytosscape（v.3.60）软件中进行可视化。用PICRUSt2软件分析原核生物群落的功能组成[16]。

2 结果与分析

2.1 理化指标和有机酸的差异分析

在发酵过程中，两组酒醅水分都是先增高后渐趋平缓。代谢所产生的水分质量分数通常是以重力作用从上自下逐渐增高[17]，因此，下层酒醅水分质量分数较高，且JJP高于CJP（图1）。相反地，两组酒醅的淀粉和还原糖含量在发酵过程中逐渐降低，且下层降幅高于上层[18]。JJP因栖息在窖泥中的菌群迁移到酒醅，并与酒醅的菌群互作，形成了良好的生态位[19]，使淀粉的利用率高于CJP，下层同样高于上层[18]。发酵15 d后，还原糖亦呈现类似趋势。发酵前期CJP上层接触了空气，菌群繁殖速率快，产生的还原糖更多。因窖泥栖息了大量产酸菌，尤其是发酵前期JJP的下层酒醅酸度大于CJP。随着发酵的进行，Methanogen、Clostridiumsp.等的种间氢转移、乳酸碳链延长、转化己酸和丁酸等的代谢速率提高，JJP的pH值在发酵30 d后降低速率减缓[19]。两组酒醅的乙醇体积分数在前、中期持续增加，且发酵前期CJP高于JJP，45 d后JJP下层的乙醇体积分数高于上层，发酵结束时，类似Gao Jiangjing等[17]报道的结果，两组间上、下层酒醅的乙醇体积分数几乎相等。

图1 发酵过程中酒醅的理化特性Fig.1 Physicochemical characteristics of fermented grains during fermentation

如图2所示，两组酒醅中4 种优势有机酸的含量在前30 d均增幅较高，随之变缓。JJP因后续发酵过程部分乳酸转化为丁酸和己酸[17]，因此后期乳酸含量低于CJP，且丁酸和己酸在上、下层的含量都高于CJP，并持续增高[20]。这些结果揭示了窖泥的重要贡献是将乳酸转化为丁酸和己酸[21]，促进了己酸乙酯等风味骨架成分的合成[22]。同时窖泥中的功能菌甲烷八叠球菌（Methanosarcina）在将乙酸转化为甲烷的同时也消耗H＋，减缓了体系的酸化，促进了己酸的合成[23]。

图2 发酵过程中酒醅有机酸的变化Fig.2 Changes in organic acid contents of fermented grains during fermentation

2.2 挥发性代谢物构成差异分析

如图3所示，窖泥显著提高了酒醅中挥发性代谢物的含量。JJP挥发性代谢物的含量在发酵过程中持续增高，而CJP仅在45～60 d缓慢增加。在15 d时，JJP下层挥发性代谢物的总含量较CJP高15.10 mg/kg，但上层仅高0.32 mg/kg，其中JJP下层酒醅乙酸含量比CJP高0.79 mg/kg，发酵60 d时，高2.29 mg/kg。经15 d发酵，JJP己酸的含量较CJP高8.60 mg/kg，发酵至60 d时，两种酒醅间己酸含量的差值高达13.57 mg/kg。发酵15～60 d，JJP和CJP下层酒醅的丁酸含量差值在2.24～2.75 mg/kg之间，而两组酒醅的这些代谢物在上层仅略有差异。乙酸、己酸和丁酸的乙酯类化合物在JJP中的含量都高于CJP，尤其是JJP下层酒醅中己酸乙酯的含量始终高于CJP，且30 d时高达7.95 mg/kg。乳酸乙酯在JJP的含量显著低于CJP。发酵结束时，JJP上、下层酒醅挥发性代谢物总量分别是90.91 mg/kg和74.92 mg/kg，但在CJP中仅分别是53.16 mg/kg和41.15 mg/kg。这些结果证实了窖泥菌群显著影响酒醅的风味轮廓，尤其显著提高了风味骨架成分己酸乙酯的含量[24]。

图3 发酵过程中对照组和窖泥组酒醅中风味代谢物的比较分析Fig.3 Comparison of flavor metabolites in fermented grains between the control and pit mud group during fermentation

酒醅中共检出了109 种挥发性代谢物，包括酯类60 种、醇类20 种、酸类9 种、醛类4 种、酮类5 种和其他类11 种。在发酵过程中，JJP挥发性代谢物的含量持续增高，且高于CJP。这些结果表明，窖泥菌群与酒醅挥发性代谢物的组成和轮廓密切相关[25]。PLS-DA的结果也显示，窖泥主要有益于提高酒醅中酯类、醇类和酸类的含量（图4A）。基于VIP＞1.0，共鉴定出了24 种差异代谢物（图4B），主要包括己酸、己酸乙酯、乙醇、亚油酸甲酯和乳酸乙酯等[8]。差异代谢物的热图分析结果也表明，JJP中差异代谢物的含量高于CJP，尤其是在发酵45 d后更明显（图4C）。发酵至15 d时，CJP下层挥发性代谢物的含量高于上层，30 d时则相反，JJP亦呈现类似变化规律。但发酵45 d后，上层酒醅代谢物的含量高于下层，包括赋予其花果香、甜味和酸味的己酸、丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯和2,3-丁二醇等浓香型白酒的特征风味代谢物[26]。这些结果揭示了窖泥对酒醅特征风味的贡献特点[27]。

图4 对照组和窖泥组酒醅挥发性代谢物的差异分析Fig.4 Differential analysis of volatile metabolites in fermented grains between the control and pit mud groups

2.3 微生物群落特征差异分析

2.3.1 群落多样性差异

扩增子测序技术检测发酵过程中酒醅微生物群落结构的结果如表1所示。发酵结束时，各酒醅细菌群落的α多样性指数低于初始酒醅FG0，但真菌群落的丰富度和多样性增加。JJP下层酒醅细菌群落的Chao1和Shannon指数都高于上层酒醅。类似Wang Shilei等[28]报道的结果，窖泥显著提高了酒醅微生物群落的丰富度和多样性。在发酵过程中，酒醅细菌群落的丰富度先增后减，在30～45 d都增至稳态，而JJP的增量大于CJP。真菌群落的多样性和丰富度指数显著低于细菌群落，真菌群落的丰富度在整个发酵过程中持续增大，45 d时多样性达到峰值后，稳定至60 d后略有降低。

表1 酒醅中微生物群落的丰富度和多样性Table 1 Abundance and diversity indexes of microbial communities in fermented grains

2.3.2 群落结构和组成差异

发酵过程酒醅细菌群落优势菌的丰度及结构差异如图5A所示。样品间属水平的差异因发酵周期而异。FG0中，优势细菌包括Lactobacillus（11.51%）、Delftia（20.77%）、Kroppenstedtia（22.88%）、Staphylococcus（14.63%）和Bacillus（10.73%）。经15 d发酵后，Lactobacillus成为绝对优势菌，曾有研究报道发酵5 d时，Lactobacillaceae的相对丰度己高达98.0%[20]。主要代谢物乳酸和乙醇能抑制酸、醇敏感菌的生长，但过量则会导致酒醅微生物群落的失衡，降低基酒的品质和产率[29]。发酵至60 d时，CJP中Lactobacillus的相对丰度降低，分别是95.88%（上层）和97.42%（下层）。Bacillus、Rhodococcus、Thermoactinomyces、Ralstonia和Pseudomonas的相对丰度增高，且上层高于下层。但在45 d时，JJP中Lactobacillus的相对丰度已经开始降低，下层（91.48%）降幅高于上层（96.85%）。窖泥降低了酒醅中Lactobacillus的相对丰度[30]，多种细菌的相对丰度增高，下层的增幅高于上层，主要包括Kroppenstedtia、Bacillus、Clostridium_sensu_stricto_12、Thermoactinomyces、Acetobacter、Ralstonia和Pseudomonas，且产己酸、丁酸及酯类化合物的重要功能菌Clostridium_sensu_stricto_12仅在JJP中检出[31]。发酵结束时，Bacillus、Rhodococcus、Thermoactinomyces和Acetobacter的相对丰度增高。整个发酵过程中，JJP中分泌淀粉酶和纤维素酶等水解酶的Kroppenstedtia的相对丰度显著高于CJP[32]。

图5 窖泥对酒醅细菌（A）和真菌（B）分布和组成的影响Fig.5 Effects of pit mud on the distribution and composition of bacterial (A) and fungal communities (B) at the genus level in fermented grains

如图5B所示，FG0中优势真菌包括Thermoascus（43.11%）、Rhizomucor（23.36%）、Thermomyces（16.97%）和Pichia（3.35%）。发酵前45 d，Thermoascus的相对丰度在两种酒醅中无显著变化，发酵结束时，CJP和JJP上、下层丰度分别降至1.30%和2.26%及6.75%和6.30%，表明CJP中嗜热酶类的活力可能被降低[33]。发酵至45d时，Rhizomucor逐渐增高至峰值，在CJP与JJP上、下层的相对丰度分别是29.13%和27.30%及24.91%和36.72%，后期则显著降低。Thermomyces的变化趋势类似Rhizomucor。在发酵前15 d，JJP的Kazachstania从0.05%增至22.26%（上层）和41.36%（下层），直至45 d时相对丰度一直较高，且高于CJP的20.29%和5.47%。Kazachstania参与多种白酒风味成分的合成，尤其是醇类（苯乙醇）及酯类化合物，赋予基酒独特的花果香[34-35]。类似地，浓香型白酒重要功能真菌之一的Pichia丰度也逐渐增高[36]。由此可见，窖泥的贡献主要是提高酒醅中部分功能菌的丰度及降低Lactobacillus的丰度。

2.4 微生物群落与挥发性代谢物的相关性分析

本实验计算了CJP和JJP中优势属和挥发性代谢物之间的Spearman相关系数[37]，选择系数|ρ|＞0.6和显著性P＜0.05作为网络节点的强相关性[38]。CJP有13 个细菌属和11 个真菌属与20 种挥发性代谢物显著相关（图6A）。JJP中有11 个细菌属和9 个真菌属与23 种挥发性代谢物显著相关（图6B）。初步确定这些属是合成挥发性代谢物的功能菌，且JJP微生物群落和挥发性代谢物的相关性比CJP的更强[38]。CJP中Bacillus、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces、Saccharopolyspora和Rhodococcus与20 种挥发性代谢物呈强正相关，对酒醅的风味特征贡献显著。Bacillus和Kroppenstedtia分泌多种耐热酶，且生产多种重要风味代谢物[32,39]。Thermoactinomyces和Saccharopolyspora与乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯和乳酸乙酯等酯类化合物显著正相关，相关研究也表明Saccharopolyspora有利于酯类化合物的产生[32]。JJP中乙醇和2,3-丁二醇与绝大多数微生物呈显著正相关。己酸是Clostridium_sensu_stricto_12的主要代谢成分，且与乙醇、3-甲基丁醇、己酸和己酸乙酯呈显著正相关，而与乙酸乙酯呈负相关[40]。对于真菌群落，Kazachstania在CJP中与乙酸乙酯呈负相关，但在JJP中与己酸和己酸异戊酯呈显著正相关。Thermoascus在CJP和JJP中与多种挥发性代谢物呈负相关，类似Zhang Yuandi等[32]报道的结果。此外，在CJP中Rhizopus、Rhizomucor和Monascus与乙醇、2,3-丁二醇和3-甲基丁醇的含量呈显著正相关，可能与这些曲霉菌的还原酶活性有关[41]。JJP中Pichia与己酸和己酸乙酯呈显著正相关[6]。

2.5 代谢通路分析

基于京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）以及差异挥发性代谢物代谢通路分析结果，构建了酒醅挥发性代谢物，相关酶的代谢网络如图7A所示，PICRUSt2预测了发酵过程中细菌群落编码相关酶的丰度（图7B）。揭示了CJP和JJP中参与淀粉代谢和主要风味成分代谢酶的组成和丰度差异，尤其糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）途径和脂肪酸合成途径[42]。JJP的EMP途径大部分酶的丰度高于CJP，意味着窖泥菌群促进了葡萄糖的转化。JJP中脂肪酸合成途径的多数酶，如己酸合成酶（EC 1.3.1.38、EC 2.3.1.16、EC 6.2.1.1），丁酸合成酶（EC 2.3.1.9、EC 2.8.3.8）的丰度也显著高于CJP，且下层显著高于上层，解释了JJP下层己酸和己酸乙酯含量显著高的原因。作为多种酯类化合物前体的脂肪酸，即可经氧化反应生成醇、酮等，亦可经酯酶（EC 3.1.1.1和EC 3.1.1.3）催化合成酯类[43]，两种酶在细菌群落中的差异表达与CJP和JJP中酯类物质的含量差异吻合。淀粉是白酒酿造所需的主要碳源，酒醅中的淀粉转化为葡萄糖、麦芽糖等还原糖，可被微生物直接利用，并通过EMP途径产生丙酮酸，然后经乳酸脱氢酶（EC 1.1.1.27）转化为乙醇[23]，乳酸脱氢酶是催化乳酸转化为乙酰辅酶A，再经链延长途径合成己酸的关键酶[44]，JJP中与乳酸相关的酶在30 d时丰度高于CJP，且下层高于上层，解释了乳酸减少和己酸增加的原因。丙酮酸发酵生成乙酸和乳酸是酒醅细菌代谢的重要特征[45]。由于JJP中EC 1.2.5.1和EC 2.8.3.18上调，乙酸的代谢量增加。乙偶姻作为2,3-丁二醇的前体，在乙酰乳酸合成酶（EC 2.2.1.6）和乙酰乳酸脱氢酶（EC 4.1.1.5）的催化下由丙酮酸衍生而来，且这两种酶在JJP发酵的第15天表达量最高。乙偶姻转化为2,3-丁二醇过程所参与的丁二醇脱氢酶（EC 1.1.1.4）在JJP的第60天表达量最高，研究结果也显示JJP中2,3-丁二醇的含量高于CJP。

图7 重要挥发性化合物和酶的综合代谢途径（A）以及相应酶的丰度变化（B）Fig.7 Comprehensive metabolic pathways of important volatiles (A) and enzymes and changes in the abundance of corresponding enzymes (B)

3 结论

窖泥在浓香型白酒发酵过程中具有重要作用，显著影响了酒醅的微生物群落结构和组成，以及挥发性风味代谢物的含量。揭示了窖泥对酒醅中细菌群落的影响，尤其是Lactobacillus的丰度，且影响了真菌群落，驱动了酒醅功能菌群的富集。窖泥显著提高了酒醅风味代谢物的含量，尤其是特征风味代谢物己酸乙酯的含量。窖泥的贡献具有空间属性，下层酒醅己酸增加量和乳酸降低量高于上层酒醅。研究结果为浓香型白酒发酵体系中风味代谢物的调控提供理论依据。