敲除TSP-1对小鼠急性肝损伤保护作用的机制

吴敏, 冯伟珂, 占一姗, 王剑巧, 曾金娣, 李科浩, 张守华, 陶强, 占敏△

1江西省儿童医院普外科(江西南昌 330038); 2九江学院附属医院(江西九江 332000); 3井冈山大学附属医院(江西吉安 343000)

急性肝损伤(acute liver injury,ALI)主要是由药物肝毒性、病毒感染、酒精滥用或肝脏缺血再灌注引起的急性肝功能障碍的重要临床综合征,常以肝细胞变性、坏死和凋亡等为病理特征[1]。ALI的恶化可导致急性或慢性肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌,如果没有得到及时有效的治疗,严重的肝损伤可能是致命的[2]。统计显示,每年每百万人中总发病率为1～6例,接近每年2 000例。在美国,ALI每年占肝脏相关死亡的6%,占原位肝移植的7%[3]。血小板反应蛋白(thrombospondin,TSP)是一个由TSP 1～5组成的多功能分泌型蛋白家族,分为A和B两个亚家族。即A家族由TSP-1和TSP-2组成,它们是具有同源结构的三聚体糖蛋白;B家族由TSP-3、TSP-4、TSP-5组成,它们是同源五聚体[4]。其中,TSP-1是一种450 kD的糖蛋白,由Baenziger等[5]首次从活化的血小板中分离出来。TSP-1的结构由6个不同的结构域组成:1个氨基端域,1个前胶原蛋白同源区,3种类型的重复(Ⅰ型重复,Ⅱ型重复,Ⅲ型重复)和一个羧基端[4]。由于其不同的结构域,它可以与多种受体相互作用,并表现出抗血管生成、促进细胞凋亡和免疫调节等的作用[6]。目前仅发现TSP-1在肾脏、血管、癌症和代谢性疾病方面的研究最为广泛[7],但在肝脏疾病方面的研究却很少。因此,本研究于2021年7月至2023年1月完成实验,旨在探讨敲除TSP-1在小鼠ALI中的作用,并从炎症反应、氧化应激和细胞凋亡等角度分析分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究中所用C57BL/6J雄性小鼠(4～6周龄,体重20～25 g)购买于长沙市天勤生物技术有限公司,许可号SCXK(湘)2019-0014;本研究采用的TSP-1基因敲除雄性小鼠(4～6周龄,体重20～25 g)购买于Jackson实验室。所有实验经伦理委员会审查和批准(JXSETYY-YXKY-20220162)。

1.2 主要药物和器械 四氯化碳(CCl4)、橄榄油购买于西陇科学股份有限公司;RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qPCR试剂盒购买于Promega生命科学公司;小鼠TSP-1酶联免疫吸附测定试剂盒、小鼠白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫吸附测定试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)酶联免疫吸附测定试剂盒、丙二醛(MDA)比色法测试盒以及谷胱甘肽(GSH)比色法测试盒购买于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;TUNEL检测试剂盒购于赛维尔生物科技有限公司;一抗(兔来源的caspase-3)、二抗(山羊抗兔)以及TSP-1和GAPDH引物购买于福州载基生物科技有限公司;离心机购买于德国艾本德股份有限公司;组织研磨仪购买于上海净信实业发展有限公司;全自动生化分析仪购买于长沙综仪生物科技有限公司;光学显微镜购买于欧普林光电有限公司;实时荧光定量PCR仪购买于美国伯乐公司;多功能酶标仪购买于上海昆亚医疗器械股份有限公司等。

1.3 实验方法

1.3.1 动物模型的建立及分组 选取16只C57BL/6J小鼠,随机分为WT组(n=8),按照橄榄油10 mL/kg 体重进行腹腔注射;WT+CCl4组(n=8),按照0.5 mL CCl4+9.5 mL橄榄油/kg(n=8),按照0.5 mL CCl4+橄榄油9.5 mL/kg体重进行腹腔注射。实验终结于禁食不禁水24 h后,在麻醉状态下采集血液和肝组织,-80℃保存备用。

1.3.2 肝组织HE染色 将肝脏组织依次进行脱水、包埋、切片、脱蜡、水化、染色、分化、脱水、透明、封片,自然晾干,置于显微镜下观察结构并拍照。

1.3.3 肝功能检测 取小鼠血液50 μL,用生理盐水稀释至200 μL,通过全自动生化分析仪测定ALT和AST水平。

1.3.4 RT-qPCR 取小鼠肝脏组织约40 mg,置于EP管中,每管加入1 mL Trizol,放入组织研磨仪5 min,然后按照RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qPCR试剂盒说明书配置反应体系,在PCR仪上进行反应,用2-ΔΔCt法计算TSP-1的mRNA的相对表达量。所用引物序列见表1。

表1 所用引物序列

1.3.5 ELISA法检测 取小鼠血清40 mL,用标准品和样本稀释液至100 mL,按照ELISA测定试剂盒说明书配置反应液,放入酶标仪上分别检测TSP-1、IL-6和TNF-α的OD值。

1.3.6 比色法检测 取小鼠肝脏组织约40 mg,置于EP管中,每管加入0.36 mL PBS液,放入组织研磨仪5 min,配置成10%组织匀浆。分别按照MDA和还原型GSH比色法说明书配置反应液,酶标仪上测OD值。

1.3.7 免疫组化法测定 切片依次进行烤片、脱蜡水化、抗原修复、消除内源性过氧化物酶、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显色、复染、分化、脱水、封片,最后将玻片晾干,显微镜下观察拍照。

1.3.8 TUNEL法检测细胞凋亡 切片依次进行烤片、脱蜡水化,用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记(TUNEL)检测肝组织中的凋亡细胞,荧光显微镜下观察拍照。

1.4 统计学方法 所有数据采用GraphPadPrism8.0及SPSS 22.0软件进行数据分析,两组间比较采用t检验,多组间比较采用方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALI伤时TSP-1的表达升高 ELISA和RT-qPCR分别检测WT组和WT+CCl4组血清和肝脏中TSP-1的表达水平。结果显示,在血清和肝脏组织中,WT+CCl4组小鼠肝脏TSP-1的表达水平均明显高于WT组小鼠(图1A、B),表明小鼠ALI与TSP-1表达具有一定相关性。

注:A:ELISA法检测小鼠血清中TSP-1的表达水平; B:PCR检测肝脏组织中TSP-1 mRNA的表达水平图1 小鼠肝脏TSP-1的表达水平

2.2 敲除TSP-1可减轻小鼠CCl4诱导的ALI 通过检测小鼠血清中ALT和AST的水平以及HE染色法观察肝脏综合评估CCl4诱导小鼠ALI情况。生化结果显示WT+CCl4组小鼠的ALT和AST显著高于WT组,而相对于WT+CCl4组,TSP-1-/-+CCl4组小鼠血清ALT和AST显著降低(图2,P<0.05);HE染色WT+CCl4组小鼠肝细胞气球样变,可见大量灶状坏死,以中央静脉周围为主,肝窦内见炎症细胞浸润。而相对于WT+CCl4组,TSP-1-/-+CCl4组坏死面积减少,仅见少许炎性细胞浸润(图3),提示敲除TSP-1可减轻小鼠受到CCl4诱导的ALI。

注:*P<0.05,**P<0.01图2 各组小鼠血清中ALT和AST

注:WT组肝细胞以中央静脉为中心放射状排列,未见坏死、气球样变;WT+CCl4组可见肝细胞呈片状坏死,肝小叶结构破坏;TSP-1-/-+CCl4组肝细胞点状坏死,少许炎症细胞浸润图3 各组小鼠肝脏病理组织学HE染色

2.3 敲除TSP-1可通过抑制炎症反应减轻CCl4所致小鼠ALI 上述3组小鼠血清,通过ELISA测定炎症因子TNF-α和IL-6水平。结果显示,与WT对照组小鼠相比,WT+CCl4组的小鼠的TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.05),而TSP-1-/-+CCl4组能显著下调CCl4诱导的血清中TNF-α和IL-6的水平(图4),提示敲除TSP-1可通过抑制炎症减轻CCl4所致小鼠ALI。

注:*P<0.05,**P<0.01图4 ELISA法检测各组小鼠血清中IL-6和TNF-α的水平

2.4 敲除TSP-1可通过抑制氧化应激减轻CCl4所致小鼠ALI 取上述3组小鼠肝脏组织,通过比色法测定氧化应激因子MDA和GSH水平。结果显示,与WT对照组小鼠相比,WT+CCl4组的小鼠肝脏组织中的MDA表达水平显著升高,GSH表达水平显著降低,而TSP-1-/-+CCl4组能显著下调CCl4诱导的肝脏组织中MDA的表达水平和上调GSH的表达水平(图5,P<0.05),提示敲除TSP-1可通过抑制氧化应激减轻CCl4所致小鼠ALI。

注:*P<0.05, **P<0.01图5 3组小鼠肝组织中MDA和GSH的含量

2.5 敲除TSP-1可通过抑制细胞凋亡减轻CCl4所致小鼠ALI 取上述3组肝脏组织切片,采用免疫组化法检测肝细胞中caspase-3表达水平以及TUNEL法综合评估肝细胞凋亡情况。结果显示,WT+CCl4组肝组织中凋亡率较WT组升高,而TSP-1-/-+CCl4组较WT+CCl4组阳性率低(图6),提示敲除TSP-1可通过抑制细胞凋亡减轻CCl4所致小鼠ALI。

3 讨论

肝病仍然是备受世界关注的全球性难题,目前对肝病损伤的病理和发病机制取得重大的研究,其中炎症、氧化应激和细胞凋亡是ALI发病机制的主要病理特征[8]。

在本研究中,我们首先成功构建了CCl4诱导的ALI小鼠模型,发现与WT小鼠相比,模型组小鼠的TSP-1明显升高(P<0.05),提示TSP-1可能参与了ALI的过程。为了进一步阐明TSP-1在ALI中的作用及其可能的机制,我们使用了TSP-1敲除小鼠,并观察到相对于WT+CCl4组小鼠,TSP-1-/-+CCl4组小鼠ALT和AST下降,肝脏损伤明显减轻,表明敲除TSP-1可减轻CCl4诱导的ALI。

IL-6和TNF-α主要是由组织单核细胞和巨噬细胞产生的促炎症细胞因子,可以诱导参与各种炎症反应的基因表达[9]。已有研究表明,TSP-1及其受体在免疫组织和参与抗炎过程的免疫细胞上表达,可以激活单核细胞和内皮细胞分泌促炎症细胞因子,如IL-6和TNF-α[10]。在本实验中,腹腔注射CCl4后,IL-6和TNF-α的表达水平明显升高,而TSP-1基因敲除组则出现下降,说明敲除TSP-1基因可以通过抑制炎症反应来减轻CCl4诱导的ALI。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是含有氧自由基的生物活性分子,在细胞生理上起着关键作用,但在高浓度时也有毒性,并能够促进病理过程[11]。ROS的毒性在于能够氧化细胞蛋白质、脂质和核酸,并通过各种信号引起细胞损伤、功能紊乱和诱发细胞死亡[12]。MDA是脂质过氧化的代谢终产物,反映了体内氧化反应的程度并诱发细胞损伤[13]。MDA含量可以间接反映氧自由基的水平,GSH的水平可以反映机体的抗氧化能力[14]。TSP-1可以促进自由基和ROS的过量产生[15]。例如,TSP-1通过激活受体CD47已被证明能刺激血管平滑肌细胞产生ROS,通过诱导氧化应激促进血管功能障碍[16]。本实验结果显示,与CCl4模型组相比,TSP-1-/-组的MDA含量明显下降,GSH含量明显上升,说明TSP-1的敲除会增加肝脏的抗氧化能力,减少脂质过氧化的形成。

凋亡是肝细胞对各种破坏性因素的第一反应,凋亡后的细胞容易发生坏死[17]。半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶的激活在氧化应激诱导的细胞凋亡过程中反复出现,对细胞凋亡过程有重要影响。半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶是细胞凋亡的关键促进因素,在介导细胞凋亡方面发挥着重要作用,并存在于多种细胞凋亡途径的交叉点[18]。因此,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是负责执行细胞凋亡的关键因素。此外,半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶的另一种作用机制是通过相互激活进行自我激活,一旦细胞凋亡开始,启动一连串的效应[19]。有研究表明TSP-1诱导的微血管内皮细胞的凋亡依赖于半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶,并由CD36受体引发的内在凋亡连锁反应所介导[20]。本实验结果显示,WT+CCl4组的肝组织中caspase-3表达上调并且TUNEL显示凋亡细胞亦显著增加,而TSP-1-/-+CCl4组的肝组织中caspase-3表达明显下降,提示TSP-1可能通过抑制caspase-3减弱细胞凋亡,从而减轻肝脏损伤。

因此,敲除TSP-1对CCl4诱导的小鼠ALI具有明显的保护作用,其机制可能与改善炎症、降低氧化应激和抑制细胞凋亡有关。未来有望通过检测TSP-1的表达水平来评估肝损伤的严重程度,为早期诊断肝损伤提供参考以及为研发靶向生物制剂精准化治疗肝损伤提供新方向。

利益相关声明:本文所有作者共同认可论文,无利益冲突。

作者贡献说明:研究设计为占敏;研究方案执行为吴敏、冯伟柯、占一姗、张守华;数据整理为占一姗、王剑巧;统计分析为曾金娣、李科浩;论文撰写为吴敏,论文评阅为占敏、陶强。