锌掺杂荧光硅量子点作为叶面光肥对生菜生长的影响

孙倩,崔曦鹏,叶勇,何瑜

(1.湖北大学化学化工学院, 湖北 武汉 430062; 2.湖北百杰瑞新材料股份有限公司,湖北 武汉 430070)

0 引言

光是万物之源,太阳光中促进绿色植物生长发育效果最明显的是蓝光和红光。蓝光有利于植物叶片生长,在植物的向光性中起主要作用。红光能促进植物发芽、开花、结果,以及叶绿体的合成[1]。然而,还有一些波段的光无法被植物有效利用。如何提高植物对光能利用率的问题一直备受关注。目前有改造植物内部基因[2-3]和创造外部环境[4-6]两方面来提高植物光能利用率的方法。相比于改造植物内部基因,创造植物外部环境进行调节的方法成本更低、更加简便高效。因此喷施叶面光肥,将叶绿素无法吸收的紫外线、黄绿色或近红外光转化为叶绿素可以有效吸收的光,提高植物对光能利用效率的研究已成为相关领域热点。

纳米颗粒一般都拥有巨大的比表面积和较高的表面能,常被应用于涂料、农业、生物和医药[7]等领域,在土壤和肥料的应用方面也有新的突破[8]。Liscano等人报道,肥料的颗粒尺寸减小能增大比表面积和肥料的溶解速率,从而加速植物对肥料的吸收[9]。关于纳米肥料对植物生长影响的研究也越来越多。叶面施用的金纳米颗粒能够通过直接渗透和气孔口运输而被西瓜吸收[10]。在叶面施用纳米氧化锌颗粒对花生种子萌发、生长和产量均有促进作用[11]。纳米粒子具有光学性质稳定、光吸收率大、发射可调、毒性低等优点,因此许多发光纳米粒子可作为叶面光肥促进植物光合作用。例如,Li等报道了具有优异水溶性、低细胞毒性和生物相容性的远红外碳点可作为增强光合作用的有效捕光剂[12]。Pan等将高分散二氧化钛纳米粒子作为叶面光肥与叶绿体(CLP)相互作用,增强光生电子转移,从而增强光合作用[13]。Lei课题组首次用荧光硅量子点(SiQDs)作人工天线来增强生菜的采光能力,该量子点能显著促进意大利生菜幼苗的生长和可溶性糖含量的提高[14-15]。目前来看,SiQDs的合成原料丰富、制备简单、水溶性好、光谱吸收范围宽、光学性质稳定、低毒且生物相容性好[16],因此在叶面光肥领域具有光明的应用前景。随着全球温室效应的加剧,紫外线辐射的强度持续增加,开发能够吸收紫外光的SiQDs对促进植物的光合作用具有重要意义。

本研究以DAMO分子作为硅源,柠檬酸钠作为还原剂,加入六水硝酸锌,200 ℃下水热合成了一种高分散性、光学性能稳定的锌掺杂硅量子点(Si@Zn QDs),并且探讨不同锌掺杂量和不同浓度的Si@Zn QDs作为叶面光肥对生菜生长的影响。与未掺杂锌的硅量子点相比,Si@Zn QDs拥有更高的荧光强度和荧光量子产率,能够提高光能利用率。硅肥有助于植物抵抗生物或非生物胁迫,如重金属毒性、干旱、盐浓度过高、细菌和病毒[17-18]。同时,锌肥可以提高叶绿体中的光合色素含量和促进生长素的合成[19]。缺锌植株会发黄矮化、叶小而变形,对农作物的产量及品质造成严重影响[20]。因此,施用螯合硅锌型纳米叶面光肥,既能利用其光肥功能,提高光能利用率,又兼备Si、Zn元素本身对植物生长的积极作用,对生菜的干鲜质量、光合色素含量和蛋白质含量有着更明显的促进效果。

1 实验部分

1.1 实验材料与试剂

N-氨乙基-γ-氨丙基二甲氧基硅烷(DAMO)、六水硝酸锌、2,6-二氯苯酚靛酚(DCPIP)、蔗糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、牛血清白蛋白、考马斯亮G-250均购于上海麦克林生化科技有限公司,氯化钾购于汕头市化学试剂厂有限公司,柠檬酸钠购于天津博迪化工有限公司,无水乙醇、丙酮均购于上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 Si@Zn QDs的合成

参考Cui等方法制备Si@Zn QDs[21]。称取0.15 g柠檬酸钠加入到8 mL纯水中,混合搅拌的同时持续通入氮气20 min。接着加入6 mL DAMO,继续通入氮气并搅拌20 min来制备前驱体溶液。然后将一定量的Zn(NO3)2·6H2O(0、0.125、0.25、0.5 mmol)加入到水溶液中并搅拌30 min。接下来,将混合物溶液加入到25 mL聚四氟乙烯衬里的高压釜中,置于反应温度为200 ℃的烘箱中12 h。自然冷却至室温后透析(截余分子量:500 Da)12 h,冷冻干燥得到目标产物SiQDs和Si@Zn QDs (0.05%、0.10%、0.20%(质量分数,下同))。

1.3 样品表征

使用透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM;型号:JEOL-2100)及 Nano Measurer 对样品形貌及粒径大小进行表征。使用傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy,FT IR;型号:Perkin-Elmer,Spectrum one)和X射线电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS;型号:Thermo Scientific,VGEscalab 200)对样品进行官能团鉴定。使用荧光光谱仪(型号: Perkin Elmer,LS55)测试样品的激发、发射荧光光谱(photoluminescence spectroscopy,PL)。使用荧光光谱仪(型号:Edinburgh Instruments,FLS1000)表征样品的荧光寿命及绝对量子产率。使用紫外分光光度计(型号: Perkin-Elmer,Lambda 35)测试样品的紫外-可见吸收光谱。

1.4 希尔反应活性检测

捣碎新鲜的生菜叶片,加入蔗糖磷酸缓冲液(包含0. 4 mol/L蔗糖、10 mmol/L氯化钾、30 mmol/L磷酸氢二钠和20 mmol/L磷酸二氢钾),过滤得到叶绿体粗提液。将粗提液离心(1 000 r·min-1)3 min,接着取上层液体离心(3 000 r·min-1)3 min得底部沉淀叶绿体。将所得叶绿体再次分散在蔗糖磷酸缓冲液,得叶绿体悬浮液。取0.10 mL叶绿体悬浮液加入到4.9 mL乙醇和丙酮的混合物中测量OD650吸光值,测量用于希尔反应活性检测的叶绿体悬浮液浓度。取2.0 mL叶绿体悬浮液(652.05 mg·L-1)与2.0 mL Si@Zn QDs分散液混合2 h。随后加入1.0 mL 500 μmol/L的DCPIP溶液。在50 W的氙灯下照射10 min,每2 min测定OD600吸光值。

1.5 生菜应用

生菜种植:品种为“意大利耐抽苔生菜”。营养液配方购于河北乾元水培电子科技有限公司。环境温度为25 ～ 30 ℃,光源为通用白色 LED 灯,光照10 h,黑暗14 h。光照的同时辅以波长为365 nm的紫外灯光照4 h。生菜处理:幼苗长至3叶1心时,将幼苗转移到水培架上定植14 d。每隔2 d将Si@Zn QDs的分散液均匀地喷施于生菜叶面上,每组3个重复,14 d后采收,测定相关指标。

1.6 光合色素含量测定

光合色素含量的测定采用丙酮乙醇混合法。取生菜鲜样叶片切碎混匀,准确称取0.2 g于20 mL丙酮/无水乙醇(1∶1)溶液的管中浸泡,放置在室温黑暗条件下,叶片完全变白为止,取上清液,利用分光光度计分别测定OD663、OD645和OD440吸光值。

1.7 可溶性蛋白含量测定

可溶性蛋白测量采用考马斯亮蓝G-250染色法[22]:称取0.5 g叶片鲜样,加5 mL去离子水,在去离子水中研磨成匀浆后采用离心机于4 000 r·min-1离心10 min。取0.1 mL上清液加入0.9 mL蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250试剂,混匀放置3 min后测定OD595吸光值。

2 结果与讨论

2.1 SiQDs和Si@Zn QDs的表征

图1 (a)Si@Zn0.10% QDs的TEM图像(插图为尺寸分布图);(b)SiQDs和Si@Zn0.10% QDs的XRD图;(c)SiQDs和Si@Zn0.10% QDs的紫外-可见吸收光谱;(d) SiQDs和Si@Zn0.10% QDs的FTIR光谱

图2 (a) Si@Zn0.10% QDs 的 XPS 图;(b) ～ (f)C 1s、N 1s、 O 1s、 Si 2p和Zn 2p的分峰拟合能谱图

接下来对Si@Zn0.10%QDs 进行光学性质表征,如图3(a)所示,在360 nm的激发下,Si@Zn QDs的最佳发射为445 nm,属于蓝色荧光。随着锌掺杂量的增加,其荧光强度增强。图3(b)是Si@Zn0.10%QDs的激发和发射光谱,在445 nm的最佳发射下,出现242 nm和360 nm两个激发峰,和它的紫外-可见吸收光谱相对应。随着激发波长的改变,Si@Zn QDs的激发峰位置保持不变,说明Si@Zn QDs没有激发依赖效应。同时,本研究制备的Si@Zn0.10%QDs绝对量子产率为69.04%,相较于SiQDs绝对量子产率57.46%,具有更高的发光效率,为提高光能利用率提供了条件。

图3 (a)SiQDs、Si@Zn 0.05% QDs、 Si@Zn 0.10% QDs、Si@Zn 0.20% QDs在360 nm激发下的荧光发射光谱;(b)Si@Zn0.10%QDs的激发和发射光谱;图b的插图:左侧和右侧分别为在日光和紫外光(365 nm)照射下拍摄的 Si@Zn0.10% QDs溶液照片

2.2 Si@Zn QDs对CLP的影响

图4(a)是CLP的激发和发射光谱,最佳激发波长和发射波长分别为430 nm和680 nm。通过CLP的紫外-可见吸收光谱可知,叶绿体进行光合作用的有效吸收范围主要在400～700 nm。我们发现Si@Zn QDs所发的蓝光正好处于生菜叶绿体光合作用的有效吸收范围内(图4(b)),说明Si@Zn QDs能将植物不可吸收的紫外光转化为蓝光,从而被叶绿体有效地直接利用。如图4(c)所示,随着逐滴加入CLP到Si@Zn QDs溶液中,在360 nm的激发下,445 nm的荧光峰逐渐猝灭。根据Si@Zn QDs的发射光谱与CLP的紫外吸收光谱显著重叠(图4(b)),推测其猝灭机理可能是内滤效应或能量共振转移。为了验证可能的机理,测定加入CLP前后Si@Zn QDs的荧光寿命。如图4(d)所示,加入CLP前后Si@Zn QDs荧光寿命分别为10.44 ns和10.35 ns,没有明显变化,证实Si@Zn QDs与CLP之间存在内滤效应。

图4 (a)CLP的荧光激发和发射光谱;(b)归一化的CLP紫外-可见光吸收光谱和在360 nm激发下Si@Zn QDs的荧光光谱;(c)在360 nm的激发下,随着CLP的逐渐滴加Si@Zn QDs的荧光光谱;(d)在450 nm发射下监测Si@Zn QDs和Si@Zn QDs/CLP的寿命衰减曲线

2.3 希尔反应活力检测

在光照条件下,叶绿体裂解水,释放氧气并还原电子受体(如DCPIP、苯醌、NADP+、NAD+等)的反应称作希尔反应[30]。通过希尔反应活性检测,我们能比较生菜的叶绿体活性。为了验证叶绿体是否将吸收的蓝光用于光合作用,以及不同锌掺杂量和不同浓度的Si@Zn QDs对光合作用的影响,我们进行希尔反应活性检测。观察不同锌掺杂量和不同浓度的Si@Zn QDs对叶绿体还原DCPIP的影响规律。图5(a)是不同锌掺杂量量子点对叶绿体还原DCPIP的影响,我们发现掺杂锌元素过后,被还原的DCPIP量增多,代表着光反应中电子传递速率加快,说明生菜的叶绿体能够吸收Si@Zn QDs发射的蓝光并用于光合作用,提高光能利用率。Si@Zn QDs的锌掺杂量为0.10%时,对叶绿体光合作用的促进效果最明显。图5(b)是不同浓度Si@Zn0.10%QDs对叶绿体还原DCPIP的影响,我们发现在一定的浓度范围内,Si@Zn0.10%QDs的浓度越大,对叶绿体光合作用的促进效果越明显。

图5 SiQDs和Si@Zn QDs对叶绿体还原DCPIP的影响 (ΔAbs表示DCPIP还原速率)(a)不同锌掺杂量的Si@Zn QDs;(b)不同浓度的Si@Zn0.10% QDs

2.4 掺锌叶面光肥对生菜的影响

2.4.1 不同锌掺杂量和不同浓度的Si@Zn QDs对生菜生长的作用

如图6(a)所示,与喷洒清水的空白对照组相比,喷洒不同锌掺杂量的Si@Zn QDs分散液(100 mg·L-1)时,生菜的干、鲜质量均有提高,说明Zn元素对生菜的生长有促进效果。其中,当锌掺杂量为0.1%时,Si@Zn QDs对生菜干、鲜质量的提高效果最明显,与希尔反应反应活性检测相一致。与对照组相比,干质量和鲜质量分别增加41.64%和52.20%. 当锌掺杂量为0.20%时,Si@Zn QDs对生菜干、鲜质量的促进效果反而减弱。这可能是生菜对锌的吸收已满足生菜正常生长的需要,锌含量过高抑制植物中其他离子的含量导致促进效果减弱[31]。如图6(b)所示,在5～100 mg·L-1的Si@Zn0.10%QDs浓度范围内,随着Si@Zn0.10%QDs浓度升高,生菜中干、鲜质量也随之增加。与对照组相比,鲜质量分别增加17.27%、26.28%、40.06%和50.19%,干质量分别增加9.54%、33.12%、47.30%和57.59%。

图6 (a)不同锌掺杂量Si@Zn QDs (100 mg·L-1)对生菜干质量和鲜质量的影响(CK为用清水处理的对照组和(b)不同浓度Si@Zn0.10% QDs对生菜干质量和鲜质量的影响(图内不同字母表示各处理在0.05水平的差异显著性)

2.4.2 不同浓度Si@Zn0.10%QDs对生菜叶片光合色素的影响

为进一步确定Si@Zn QDs对生菜光合作用的影响,我们采用丙酮乙醇混合法测定不同浓度Si@Zn0.10%QDs处理后的生菜叶片中光合色素含量。叶绿素作为植物光合作用中的主要色素,在光吸收和转化为化学能中起着核心作用。如图7所示,在0～100 mg·L-1的范围内,光合色素含量随着Si@Zn0.10%QDs浓度的升高而增大。相比于空白对照组,100 mg·L-1的Si@Zn0.10%QDs处理后的生菜叶片中叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量分别提高了60.56%、56.37%、61.20%和49.75%。由此可见,生菜幼苗能够吸收来自Si@Zn QDs的转换光,使叶绿素含量增加,促进光合作用以及生菜幼苗的生长。

2.4.3 不同浓度Si@Zn0.10%QDs对生菜蛋白质含量的影响

此外,我们还采用考马斯亮蓝G-250染色法测定不同浓度Si@Zn0.10%QDs处理的生菜中可溶性蛋白含量。如图8所示,在0～100 mg·L-1的Si@Zn0.10%QDs浓度范围内,随着浓度升高,生菜中可溶性蛋白含量增大,与对照组相比分别增加5.44%、12.99%、22.10%和29.90%。这说明Si@Zn0.10%QDs作为叶面光肥能够提高生菜中蛋白含量。通过以上实验,我们可知掺锌叶面光肥对生菜的干鲜质量、光合色素含量以及蛋白质含量的提高均有促进作用。

图8 Si@Zn0.10% QDs的浓度对生菜蛋白质含量的影响CK为用清水处理的对照组,不同字母表示各处理在0.05水平的差异显著性

3 结论

采用水热法成功制备了小尺寸、水溶性好、性能优异的Si@Zn QDs。Si@Zn QDs在360 nm的紫外光激发下产生能与叶绿体的吸收相匹配的蓝色发射,Si@Zn QDs与叶绿体混合时,荧光峰被猝灭,其原理是内滤效应。通过希尔反应活性检测表明,Si@Zn QDs与叶绿体共存时,能够提高叶绿体的电子传递速率。通过生菜种植实验,证实适宜锌掺杂量的 Si@Zn QDs作为叶面光肥能够将太阳能的紫外光转化为植物可吸收的蓝光,促进生菜的光合过程,提高能量的利用和转换效率,也减弱了紫外线对植物的毒性。同时,Si@Zn QDs能够显著提高生菜的干鲜质量、光合色素含量和蛋白质含量。因此,本研究表明,Si@Zn QDs利用荧光硅量子点的转光功能及锌元素的营养作用,作为叶面光肥应用于生菜种植具有一定的可行性和有效性。