黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的影响及机制研究

芦凌羽，王林洪

小胶质细胞是中枢神经系统中的免疫细胞[1]，其被激活后大量表达白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6），而IL-6 介导慢性炎症反应[2]，在许多炎症反应中表达升高[3]，并将信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）通路激活，导致炎症反应加强，可促进视网膜变性及细胞凋亡的发生。IL-6/STAT3 是经典的炎症信号通路，而该通路可进一步促进小胶质细胞的激活，形成了一个正反馈循环，加重了视神经变性及神经节细胞的凋亡[4]。近年来，中药在慢性疾病的治疗中被广泛应用[5]，黄芩苷是从中药黄芩中提炼出来的黄酮类化合物，有抗炎、抗氧化作用[6]。有研究[7]表明，天然黄酮类化合物有改善糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的作用，并且对链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠神经病变也有预防作用。本研究旨在讨论黄芩苷对小胶质细胞激活的影响，及作用机制是否与IL-6/STAT3信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60 只雄性SD 大鼠，6 周龄，体重200～250 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号[SCXK（京）2021-0001]。所有大鼠在恒温恒湿的环境饲养，自由进食，室温20～22 ℃，昼夜循环照明，定期检查大鼠眼部健康状况。本研究实验动物及实验所用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》相关规定。

1.2 药品、试剂与仪器

链脲佐菌素（上海柯意哲科学实验室，SS9500），黄芩苷（西安圣青生物科技有限公司，S31635），苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色剂（南京建成生物工程研究所有限公司，20210102），冰醋酸（天津市化学试剂公司，20201122），STAT3 引物、IL-6 引物（上海弗元生物科技有限公司，GS0830、KT1340），鼠抗簇分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）抗体、鼠抗STAT3 抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，SC20020、SC8019），实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，BL698A）。多功能智能显微镜、光学显微镜（日本OLYMPUS公司，BX-64、CKX53），石蜡切片机、烤片机（科迪仪器设备有限公司，KD-202A、KDTHII），PCR 仪（美国贝克曼库尔特公司，ABI7500）。

1.3 糖尿病大鼠模型建立

选取40 只大鼠，单次腹腔注射STZ 建立糖尿病模型。将STZ 溶于柠檬酸钠溶液中，以60 mg/kg 的剂量腹腔注射，其余20只大鼠腹腔注射等剂量柠檬酸钠溶液。连续3 d 测定大鼠空腹血糖，将每次血糖均≥16.7 mmol/L 的大鼠判断为糖尿病模型建立成功[8]。若造模过程中出现死亡或者血糖不达标的大鼠不计算在内，继续选取同批大鼠进行造模，确保最后造模成功的大鼠总数为40只。

1.4 分组与给药

将造模成功的大鼠随机分为模型组（model group，MG）和黄芩苷组（baicalin group，BG），另将对照的20 只大鼠设为对照组（control group，CG），每组20 只。BG 组大鼠给予黄芩苷水溶液（50 mg/kg）每日清晨灌胃，CG 组、MG 组大鼠给予同体积的蒸馏水灌胃，连续给药12 周。在整个研究过程中，密切观察大鼠的生理状态，剔除生理状态差、体重差异大以及在实验中死亡的大鼠后，在12 周时发现BG组剩余17 只、MG 组剩余14 只、CG 组剩余19 只，于每组中再次采用随机抽样的方法各选取12 只大鼠进行实验。

1.5 标本取材

所有大鼠在12 周时先禁食12 h，然后测量血糖并记录。麻醉后立即摘取大鼠右眼眼球，浸入固定液中固定30 min 后取出眼球，在眼球左右对称开口，再次放入固定液中固定24 h，进行石蜡切片，用于组织病理学实验。

1.6 HE染色

切片常规脱蜡后水化，分别使用苏木素和伊红进行染色，然后进行梯度浓度乙醇和二甲苯浸泡，最后向切片滴入中性树胶封片，静置于通风处24 h。自然风干后放入切片盒中，使用光学显微镜检查视网膜形态，选取合适视野进行拍摄。

1.7 免疫组织化学法测量CD68蛋白表达

切片常规脱蜡后水化，进行抗原修复，封闭10 min。重复洗涤3 次后，滴加鼠抗CD68 抗体（稀释比例1∶200），放入4 ℃冰箱24 h。次日洗涤3 次后，加入试剂B，放置入湿盒中20 min，再次洗涤3次。然后加入试剂C，室温下反应10 min，洗涤3 次。显色后放入苏木素中30 s 进行复染，洗涤后再加至梯度浓度乙醇和二甲苯中浸泡。最后滴加中性树胶风干，在显微镜下拍照。以细胞核呈现棕黄色的细胞为阳性表达，使用Image-Pro Plus 软件测量光密度值。

1.8 免疫荧光法测量STAT3蛋白表达

切片常规脱蜡后水化，进行抗原修复，封闭10 min。重复洗涤3 次后，滴加鼠抗STAT3 抗体（稀释比例1∶200），放入4 ℃冰箱24 h。次日洗涤3 次后，滴加羊抗鼠二抗（稀释比例1∶200），室温下避光孵育60 min，再次洗涤后，进行染色，于显微镜下观察并拍照。

1.9 RT-qPCR法测定IL-6、STAT3 mRNA的相对表达量

提取视网膜组织中RNA，RNA 通过逆转录酶合成cDNA，进行逆转录。按照说明书配置及设计引物（表1），将试剂在管内混匀，每个样本设置3 个副孔，放入PCR 仪中，进行扩增。首先94 ℃反应3 min，然后94 ℃反应20 s→60 ℃反应20 s→72 ℃反应30 s，循环40次，最后72 ℃反应5 min。以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照蛋白，以相对定量法2-△△Ct计算IL-6、STAT3 mRNA的相对表达量。

表1 qRT-PCR实验相关引物信息

1.10 统计学方法

本研究采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较采用LSD-t检验。当P＜0.05 时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜形态的影响

与CG 组相比，MG 组大鼠视网膜神经节细胞（retina ganglion cell，RGC）丢失明显增多，而经黄芩苷治疗后的BG 组大鼠RGC数量增加；MG组大鼠视网膜厚度较CG 组薄，而BG 组大鼠视网膜厚度较MG组厚（图1）。

图1 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜形态的影响（HE染色，×200）

2.2 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的影响

CG 组小胶质细胞局限在内核层；MG 组小胶质细胞数量增多，且分布在视网膜的每一层中；BG 组小胶质细胞数量较MG 组少，且小胶质细胞迁移受限（图2）。3组间大鼠视网膜小胶质细胞CD68表达比较（表2），差异有统计学意义（F=28.000，P=0.000）。MG 组CD68 表达高于CG 组（t=7.348，P=0.000），BG 组CD68 表达低于MG 组（t=2.449，P=0.019），差异均有统计学意义。

图2 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜小胶质细胞激活的影响（免疫组织化学染色，×200）

表2 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达的影响（±s，n=12）

表2 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜CD68和STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达的影响（±s，n=12）

注：* 与CG 组比较，P＜0.05；# 与MG 组比较，P＜0.05；CG 对照组；MG 模型组；BG 黄芩苷组；CD68 簇分化抗原68；STAT3 信号转导和转录激活因子3；IL-6 白细胞介素-6。

IL-6 mRNA 1.00±0.52 3.78±0.18*2.43±0.17#209.75 0.000组别CG组MG组BG组F值P值CD68 0.09±0.01 0.12±0.01*0.11±0.01#28.000 0.000 STAT3 mRNA 1.00±0.49 2.19±0.10*1.18±0.09#57.365 0.000

2.3 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜STAT3、IL-6 表达的影响

CG 组视网膜STAT3 表达主要分布在内丛状层，而MG 组视网膜各层均有大量STAT3阳性表达，BG 组视网膜各层中STAT3 表达明显弱于MG 组（图3）。3 组间大鼠视网膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA的表达比较（表2），差异均有统计学意义（FSTAT3=57.365、FIL-6=209.75，均P=0.000）。MG 组视网膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA 表达高于CG 组（tSTAT3=9.935、tIL-6=17.501，均P=0.000），BG 组视网膜STAT3 mRNA、IL-6 mRNA表达低于MG组（tSTAT3=8.432、tIL-6=9.944，均P=0.000），差异均有统计学意义。

图3 黄芩苷对糖尿病大鼠视网膜STAT3表达的影响（免疫荧光染色，×200）

3 讨论

在健康的视网膜中，小胶质细胞通过释放神经保护因子和抗炎因子参与视网膜防御免疫系统。然而，如果持续面对炎症刺激，长期激活的小胶质细胞会释放过量的细胞因子而导致神经炎症[9]，致使神经节细胞凋亡。因此，针对小胶质细胞的药物治疗以减轻慢性神经炎症，可能是保护神经节细胞的一种有效的方法。

黄芩苷是一种多靶点药物，具有抗氧化和抗炎等多种保护作用。IGNACIO S 等[10]发现，使用黄芩苷干预肌萎缩侧索硬化症模型小鼠，使CD68 等小胶质细胞标志物的表达下调。还有研究[11]表明，黄芩苷可能是调节中枢神经系统炎症反应和细胞凋亡的药物。因此，为了评估黄芩苷是否可以抑制小胶质细胞的激活，本研究对小胶质细胞标记物CD68进行免疫组织化学染色以定量定位观察，发现CG组大鼠视网膜上只有在视网膜内核层中可以检测到小胶质细胞，而MG 组大鼠除了内核层中小胶质细胞增多外，其余各层中也出现了小胶质细胞。值得注意的是，黄芩苷治疗后的BG 组大鼠视网膜各层中的小胶质细胞显著减少，几乎阻止了DR 导致的小胶质细胞激活，表明经黄芩苷干预后，在一定程度上可抑制小胶质细胞的激活。

IL-6 是激活的小胶质细胞高表达的炎症因子，而IL-6 与其受体复合物的结合可导致STAT3 的激活，并激活细胞内外2 条促凋亡信号通路。研究[12]表明，受体结合后通过直接的凋亡作用或者采用间接干扰生长因子，如胰岛素样生长因子-1（insulinlike growth factors-1，IGF-1）和胰岛素受体的细胞内物质，来诱导神经元死亡。而这些细胞内物质的最可能来源是视网膜小胶质细胞，引起促炎细胞因子的分泌增加，进一步使视网膜炎症反应加剧，导致视网膜变性及神经节细胞的凋亡[13]。在本实验中可发现，经黄芩苷治疗后的BG 组大鼠视网膜中STAT3 mRNA 及IL-6 mRNA 的表达量较MG 组大鼠下降，表明黄芩苷抑制了STAT3和IL-6的表达。

综上所述，本研究发现黄芩苷可抑制DR 大鼠模型视网膜的小胶质细胞的激活，降低了各项炎症指标，该作用机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。本研究可为DR药物研发提供新的方向。