血清外泌体hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896在肺腺癌中的筛查价值

陈贝娥,曹鹏驹,陈发林(.福州市晋安区医院体检科,福州 35004;.福建省立医院检验科,福州 35000)

外泌体是肿瘤微环境(TME)细胞间通讯的重要信使,可通过细胞间通讯促进肿瘤的发生、发展[1]。外泌体环状RNA(circRNA)具有外泌体功能传递和circRNA转录调控的双重特性,在肿瘤的发生、发展过程中起着重要作用,为肿瘤的诊断、靶向治疗、转移预后等研究提供了新的依据。Shang等[2]研究发现,外泌体circ_PACRGL可通过靶向miR-142-3p/miR-506-3p-TGF-β1轴,促进结直肠癌的进展。本课题组在前期研究[3]中对5例肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和5例体检健康者进行全转录组二代测序并构建了circRNA差异表达谱,选择LUAD患者中P值差异较小的3个外泌体circRNA(hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896)作为候选circRNA,初步检测了其在LUAD患者中的表达水平。本研究拟采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测上述3个circRNA在LUAD患者血清及外泌体中的表达水平,并进一步分析三者在LUAD患者手术前后血清外泌体中表达水平的差异,评估其临床筛查效能及其与LUAD患者临床病理参数的相关性,旨在寻找有筛查价值的LUAD生物学标志物。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2020年7月至2022年2月在福建省立医院胸外科就诊的3批次首诊为LUAD患者血清样本240例和体检健康人群血清样本94例。分组如下:(1)血清外泌体组:收集LUAD患者血清外泌体样本127例,其中男50例,女77例,年龄(55.9±12.0)岁,健康人对照组血清外泌体样本53例,男23例,女30例,年龄(48.1±12.1)岁。(2)血清组:收集LUAD患者血清样本87例,其中男43例,女44例,年龄(56.3±12.0)岁,健康人对照组血清样本41例,男20例,女21例,年龄(47.0±12.8)岁。(3)手术前后血清外泌体组:收集LUAD患者术前与术后血清外泌体样本26例,男8例,女18例,年龄(57.8±12.1)岁。LUAD纳入标准:(1)病例组术后组织活检确诊为LUAD,肺癌分类和诊断标准依据中华医学会肿瘤学分会肺癌临床诊疗指南(2021版)分类规定[4],病理分期依据国际抗癌联盟恶性肿瘤TNM分期标准[5];(2)LUAD为原发灶,既往未进行肺癌的相关治疗。排除标准:(1)患严重心脑血管、肝肾功能不全、免疫系统等基础疾病;(2)不符合纳入标准。收集各组研究对象的一般资料(包括年龄、性别、是否吸烟、既往病史、血清CEA水平等)和术后病理资料(包括病理分型、肿瘤分期等)。本研究经福建省立医院医学伦理委员会批准(批准文号:K-2021-040-04),各研究对象知情同意。

1.2主要试剂及仪器 exo RNeasy Midi Kit-77144试剂盒、QIAzol Lysis 试剂(德国Qiagen公司),氯仿、分析纯无水乙醇(宁波萃英化学技术公司),PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(日本TaKaRa公司),PCR 8联管、96孔板(美国Axygen公司),PCR引物(福州尚亚生物科技公司),CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP测定试剂盒(瑞氏Roche公司)。Roche LightCycler480实时荧光定量PCR仪、Cobas e602电化学发光仪(瑞士Roche公司),Veriti梯度PCR仪(美国ABI公司),5424R台式高速低温离心机(德国Eppendorf公司),Nano Drop 2000超微量分光光度计(美国Thermo公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 患者均于入院时(体检健康者于体检时)采用真空促凝采血管收集清晨空腹状态下外周血5 mL, 1 000×g离心10 min,分离血清,分装至EP管中,置于-80 ℃保存。

1.3.2外泌体、外泌体总RNA提取及逆转录反应 按照exo RNeasy Midi Kit-77144试剂盒说明书(分为超高速离心法提取外泌体囊泡以及QIAzol Lysis 试剂提取外泌体总RNA两步)提取血清外泌体组和健康人对照组、手术前后血清外泌体组的血清外泌体以及血清外泌体总RNA。用 NanoDrop 2000 超微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度,取吸光度 (A260 nm/A280 nm)值为1.8～2.0的样本,按PrimeScriptTMRT reagent Kit 试剂盒说明书将外泌体总RNA逆转录为cDNA,样本浓度稀释至200 ng/μL,置于-20 ℃保存。

1.3.3引物设计及qRT-PCR反应 根据circBase数据库(http://www. circbase.org/)提供的引物序列号,用Primer Premier 5.0软件设计引物,并送福州尚亚生物科技有限公司合成。引物序列见表1。按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒及Roche LightCycler480实时荧光定量PCR仪说明书操作对circRNA的表达量进行检测。以GAPDH作为内参基因对候选circRNA表达量进行校准,circRNA qRT-PCR总反应体系为20 μL,包括cDNA模板2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μL,DEPC水6.4 μL。qRT-PCR反应条件:95 ℃预变性 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40个循环。熔解曲线反应条件:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。采用LightCycler 480软件在60 ℃时采集荧光信号并进行熔解曲线分析,以曲线产生单一的目标峰值被认为结果可靠, 候选 circRNA的相对表达水平以2-ΔΔCt法计算,公式:ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。每组设3个复孔,重复3次。

表1 RT-PCR引物序列及产物大小

1.3.4血清各项肿瘤标志物检测 采用Roche Cobas e602电化学发光分析仪与配套的CEA试剂盒检测各组血清CEA、NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP的表达水平。操作步骤严格按照仪器及试剂说明书进行。CEA参考区间为0～5 ng/mL。NSE、SCC、CYFRA21-1、ProGRP参考区间分别为 0～16.3 ng/mL、0～2.7 ng/mL、0～3.3 ng/mL、0～68.3 pg/L。

2 结果

2.1qRT-PCR检测各研究对象血清及外泌体hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的表达 血清外泌体组及血清组检测结果显示,LUAD患者血清外泌体hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的表达水平相对于健康人对照组均显著上调。而血清外泌体组与血清组中LUAD患者与健康人对照组3个circRNA的表达水平差异均无统计学意义。见表2。

表2 LUAD患者与健康人对照组3个circRNA的表达水平

2.2ROC曲线评估3个circRNA对LUAD的筛查效能 与健康人对照相比,血清外泌体组LUAD患者hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的ROC曲线下面积(AUCROC)均高于血清组。见表3、图1。

注:A,血清外泌体组中3个circRNA对LUAD的筛查效能;B,血清组中3个circRNA 对LUAD的筛查效能。图1 3个circRNA在血清外泌体组与血清组中对LUAD的筛查效能

表3 3个circRNA在血清外泌体组及血清组中的 ROC曲线分析

2.3血清外泌体组中3个circRNA与LUAD患者临床病理参数的关系 在血清外泌体组的127例LUAD患者中,剔除TNM病理分期不明确的12例,最终纳入115例进行后续分析。以hsa_circ_0001439,hsa_circ_0001492,hsa_circ_0000896三者表达水平的中位数为截断值分为低表达(n=58)和高表达(n=57)两组。结果显示,血清外泌体hsa_circ_0001439在LUAD患者中的表达水平与T分期、TNM分期相关(P<0.05);血清外泌体hsa_circ_0001492在LUAD患者中的表达水平与年龄、M分期相关(P<0.05),并与T分期、TNM分期显著相关(P<0.01);血清外泌体hsa_circ_0000896在LUAD患者中的表达水平与年龄相关(P<0.05),且与T分期、TNM分期显著相关(P<0.01)。见表4。

表4 3个血清外泌体circRNA表达水平与LUAD患者临床病理参数的关系

2.43个血清外泌体circRNA与各项肿瘤标志物的相关性 Pearson相关分析结果显示,3个血清外泌体circRNA与CEA、NSE、SCC、ProGRP、CYFRA21-1的表达水平均无显著相关性(P>0.05)。见表5。

表5 3个血清外泌体circRNA与各项肿瘤标志物的相关性

2.5qRT-PCR检测 3个血清外泌体circRNA在手术前后LUAD患者中的表达 结果显示,hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896在LUAD患者术前的表达水平分别为0.989±1.746、3.084±2.013、3.330±2.088,显著低于术后(分别为3.392±1.387、5.023±1.387、6.203±1.567),差异具有统计学意义(t值分别为5.711、4.197、4.966,P<0.001)。

3 讨论

circRNA在肺癌的进展过程中发挥重要作用。本研究发现外泌体circRNA(hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896)在LUAD患者中的表达水平显著高于健康人对照组,hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896在LUAD和健康人对照组的AUCROC分别为0.777、0.766、0.793,具有较好的筛查效能。本研究中增加了LUAD患者血清组检测,发现血清组与血清外泌体组中hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492、hsa_circ_0000896的表达水平差异无统计学意义。

有研究指出,hsa_circ_0001439受下游hsa-miR-452-5p、hsa-miR-4676-3p的调控,并且与锌指蛋白644(zinc finger protein 644,ZNF644)、相应癌旁非肿瘤组织中β-环连蛋白抑制基因1(dishevelled-binding antagonist of beta-catentin 1,DACT1)密切相关;hsa_circ_0001492受下游hsa-miR-106a-3p、hsa-miR-1236-3p的调节,与卷曲螺旋结构域蛋白43(coiled-coil domain containing 43,CCDC43)、胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein 5,IGFBP5)基因紧密联系[3]。hsa_circ_0000896尚未见报道下游调控基因。笔者进一步对3个血清外泌体circRNA与LUAD患者临床病理参数进行分析,发现血清外泌体hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和 hsa_circ_0000896在LUAD患者中的表达水平与T分期、TNM分期密切相关,表明3个血清外泌体circRNA对LUAD的临床分期具有参考价值,是影响LUAD患者生存的重要因素。另外,进一步检测LUAD患者手术前后血清外泌体circRNA的表达水平,发现hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和 hsa_circ_0000896在LUAD术后组表达量显著下调,表明LUAD实体瘤可能大量表达hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896。

本研究也存在一定的不足之处:(1)本研究纳入的临床样本数量和晚期LUAD样本数量有限,未考虑将肺部其他疾病纳入研究范围,后期需要继续扩大样本量深入研究,并开展术后病例追踪研究,为LUAD的诊疗、预后提供参考价值;(2)健康人对照组只进行CEA检测,相关的NSE、SCC、ProGRP、CYFRA21-1缺少数据,因此无法比较分析LUAD和健康人对照组血清NSE、SCC、ProGRP、CYFRA21-1水平。(3)hsa_circ_0001439、hsa_circ_0001492和hsa_circ_0000896在LUAD中的生物学功能和作用机制仍不清楚,有待于进一步探索研究。