补肾中药复方对高盐摄入去卵巢大鼠骨代谢及ENaCα、NCC和ClC-3表达的影响*

崔 琰， 孙珂焕， 詹小瑶， 莫 枢， 肖雅雯， 王攀攀，杨 丽， 张荣华△， 朱晓峰△

（1暨南大学附属第一医院，广东 广州 510632；2暨南大学中医学院，广东 广州 510632；3深圳市第二人民医院，广东 深圳 518025；4深圳市中医院，广东 深圳 518000；5暨南大学药学院，广东 广州 510632）

骨质疏松症（osteoporosis， OP）是具有骨密度降低和骨微结构破坏特点的慢性疾病，由其引发的脆性骨折是患病群体失能、失用的主要原因，骨质疏松症已经成为我国50 岁以上人群的重要健康问题之一，绝经后女性骨质疏松问题尤为严重[1］。随着饮食与骨代谢疾病关系研究的深入，饮食营养已经成为与内分泌失调、代谢紊乱及机械因素同样显著影响OP发生的主要因素之一[2-3］，尤其氯化钠在饮食调味中居于主导地位，高盐饮食作为饮食偏嗜最常见的类型，已被证实不仅与高血压、心脑血管病、肾脏病、肿瘤及肥胖等的发生有关[4-6］，同时也是加速骨丢失的因素之一。

离子通道是细胞膜上一类调节和转运特异离子穿膜的通道，也是一类特殊亲水性蛋白质微孔道，存在于机体内多种生命活动过程，并参与调节细胞的增殖、分化和凋亡[7］。参与骨代谢的间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞上表达多种离子通道如钠通道、氯通道、钙通道等的功能障碍与骨代谢疾病关系密切，这些离子通道不仅调节骨系细胞的增殖、分化和凋亡等生理活动，还参与多种信号转导过程，进而影响骨代谢[8］。

补肾中药复方（Bushen formulae， BHF）是张荣华教授依据骨质疏松症肾虚血瘀病机特点，以补肾活血壮骨为治法开处的临床验方，临床治疗OP 时取得了良好疗效[9］。本研究以高盐摄入的去卵巢大鼠为研究对象，从骨代谢、电压门控性氯离子通道3（chloride channel of the ClC gene family， ClC-3）、上皮钠离子通道α（epithelial sodium channel α， ENaCα）、钠-氯同向转运体（Na-Cl cotransporter， NCC）为切入点，探讨补肾中药复方对不同饮食干预的去卵巢大鼠骨代谢的作用机制，拓展补肾中药复方对骨代谢疾病的多靶点网络药理学机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物

于广东省医学动物中心购买SPF 级3 月龄SD 雌鼠80 只，体重为190～210 g，许可批号：SCXK（粤）2013-0002。饲养于广州博济生物医药公司，饲养环境条件：环境通风良好、安静，相对湿度控制在45%～50%，温度控制在（23±2） ℃。本项目通过广州博济生物医药公司动物伦理委员会审查。

2 主要仪器与试剂

2.1 主要试剂 骨代谢生物标志物指标检测ELISA 试剂盒购于上海酶联生物；大鼠ENaCα、ClC-3 多克隆抗体（Alomone Labs），NCC多克隆抗体（Arigo）。

2.2 仪器 Prodigy 型双能X 线骨密度仪（GE）；Micro-CT 仪（ZKKS-Sharp-MCT）； 全自动生化分析仪（HITACHI 7600-020）；梯度PCR 仪（Veriti 96-Well，ABI）；荧光定量PCR仪（ABI7500）。

3 方法

3.1 药物制备 补肾中药复方由淫羊藿、熟地、骨碎补、当归、秦艽、中膝和枸杞等7 味药组成，配比与煎煮方法同既往研究[10］，药液浓缩至生药量1 g/mL，干预剂量为7.8 g·kg-1·d-1，每日1次。

3.2 高盐饲料 实验用不同质量分数高盐饲料购置于广东省医学实验动物中心，等级A 级。除了添加不同含量的氯化钠外，其余均按照常规哺乳动物饮食营养成分添加。氯化钠含量（质量分数，w/w）分别为：正常饲料（含0.5%氯化钠）、中等高盐饮食组饲料（含2.0%氯化钠）和高盐饮食组饲料（含8.0%氯化钠）。

3.3 去卵巢大鼠造模 大鼠饲养3 个月后，将6 月龄80 只SPF 级大鼠经随机数字表法为假手术组（10只）、去卵巢手术（sham）组（70 只），去卵巢手术（ovariectomy，OVX）组切除大鼠双侧卵巢，假手术组仅切除少量卵巢旁脂肪。具体操作步骤：SD 大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（2 mL/kg）麻醉后，仰卧位固定，腹部术区进行剃毛、消毒，沿腹白线纵行切口约2 cm 以打开腹腔，去卵巢组找到双侧卵巢后予切除并止血，假手术组仅切除少量卵巢旁脂肪，术闭逐层缝合腹腔。

3.4 动物分组及干预 造模1 周后，按随机数字表法将去卵巢手术组大鼠分为模型组（OVX 组）、中高盐饮食（medium-high-salt diet， MSD）组、高盐饮食（high-salt diet， HSD）组、补肾中药复方（BHF）组、补肾中药复方+生理盐水（BHF+NS）组、补肾中药复方+中高盐饮食（BHF+MSD）组和补肾中药复方＋高盐饮食（BHF+HSD）组，每组各10 只。除补肾中药复方+生理盐水组饮水采用生理盐水模拟淡盐水送服外，其余均自由饮水和获取所供不同的饲料，药物剂量组分别给予相当于成人临床剂量的3 倍连续给药灌胃12周。

3.5 骨代谢生物标志物检测 采用普通非抗凝采血管采集各组大鼠腹主动脉血液样本，4 ℃静置分层后，离心取上层血清，依据ELISA 检测试剂盒说明书操作检测血清中骨钙素（bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein，BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）、Ⅰ型胶原羧基端肽（carboxy-terminal telopeptide of type Ⅰcollagen，CTX）、I 型胶原氨基端肽（N-terminal telopeptide of type I collagen，NTX）、雌二醇（estradiol 2，E2）。

3.6 骨组织蛋白表达的检测 制备浓缩胶浓度为4%、分离胶浓度为10%的电泳凝胶，安装好电泳装置，按设计好的上样顺序缓慢上样，微量加样器吸取10 μL 样品缓慢加入样品孔，SDS-PAGE 电泳结束后经转膜、洗膜后，置于摇床上封闭1 h，分别与ClC-3、ENaCα、NCC、GAPDH Ⅰ抗稀释液（1∶1 000）在4 ℃条件下孵育过夜。与Ⅱ抗工作液（1∶2 500）在室温下孵育1 h 后，应用化学发光试剂显影，检测各条带的灰度值，数据处理，分析蛋白的表达。

4 统计学处理

统计学处理数据运用SPSS 22.0统计软件分析。结果符合方差齐性检验的数据，采用one-way ANOVA，当P＜0.05时，用Tukey HSD 进行两两比较；方差不齐时采用Brown-Forsythe 和Welch 检验，当P＜0.05时，两两比较采用Dunnett’T3 法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠股骨骨微结构、骨密度、骨参数比较

在第12 周末检测骨密度，如图1 所示，与假手术组比较，OVX 组大鼠骨密度显著降低 （P＜0.05）；与模型组比较，中高盐组和高盐组骨密度进一步下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），而补肾方组股骨骨密度显著增加（P＜0.05）。进一步分析各组骨参数显示，与假手术组比较，模型组大鼠骨体积分数[BV/TV（%）］、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著降低（P＜0.05），而骨小梁间距（Tb.Sp）则显著增加（P＜0.05）；而高盐摄入后去卵巢大鼠骨微结构则进一步破坏，表现为BV/TV（%）、Tb. N 、Tb. Th 的进一步下降与Tb. Sp 上调，补肾复方摄入后可显著改善去卵巢模型大鼠骨微结构破坏，经补肾方治疗的中高盐饮食摄入大鼠的骨参数较中高盐大鼠均有改善（P＜0.05）；同样，高盐摄入并予补肾复方干预组其骨参数均较高盐组有显著改善（P＜0.05）。此外，与补肾方组比较，补肾方+生理盐水组的BV/TV%下调且Tb.Sp 上调（P＜0.05），说明生理盐水的摄入对于补肾复方药效发挥存在一定影响。

Figure 1. Comparison of bone mineral density and bone microarchitecture parameters by Micro-CT in each group. Mean±SD. n=4.*P＜0.05 vs sham group； ‡P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.图1 各组大鼠股骨骨密度、骨参数比较

2 各组大鼠骨代谢生物标志物指标比较

如图2 所示，模型组大鼠E2、PINP、BGP 较假手术组下降，但TRACP、CTX、NTX上调（P＜0.05），表明其骨形成能力下降而骨吸收增强。中高盐摄入后不同程度升高CTX、BGP、PINP 水平，高盐饮食摄入后进一步下调E2 水平并上调CTX、NTX、BGP、PINP 水平（P＜0.05），表明不同浓度高盐饮食加剧模型大鼠高骨转换状态。补肾方干预后，去卵巢大鼠PINP 表达上调，而CTX水平下降（P＜0.05）；并且补肾方干预可提升高盐饮食大鼠E2、BGP水平，并下调骨吸收标志物CTX水平（P＜0.05）。同时，在中高盐、高盐饮食摄入的基础上，补肾方能够分别下调其CTX 及BGP水平（P＜0.05）。此外，补肾方+生理盐水组大鼠CTX水平较补肾方组升高（P＜0.05），其余骨代谢生物标志物无显著差异。

Figure 2. Comparison of bone metabolism biomarkers in each group. Quantification of serum E2， TRACP， CTX， NTX， BGP and PINP by ELISA. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group； ‡P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.图2 各组大鼠骨代谢生物标志物指标比较

3 各租大鼠骨组织病理形态变化比较

如图3 所示，假手术组大鼠股骨远端松质骨部位骨小梁形态结构完整，数量密集且排列整齐，骨小梁间可互相连接成网状，腔内骨髓细胞数量丰富。模型组大鼠股骨骨小梁稀疏，游离端多，网状结构破坏，骨髓内空泡状脂肪细胞明显增多；与模型组比较，中高盐组和高盐组大鼠股骨骨小梁稀疏、网状结构破坏进一步加重，脂肪细胞增多；补肾方组可见股骨骨小梁数量增多，网状结构修复，脂肪细胞变少。经补肾复方干预后，补肾方+中高盐组和补肾方+高盐组可见骨小梁数量增多，网状结构略微修复，脂肪细胞变少。

Figure 3. HE staining of femur in each group （scale bar=200 μm）.图3 各组大鼠股骨HE染色

4 各组大鼠骨组织ENaCα、ClC-3 和NCC 蛋白水平比较

如图4 所示，相较于假手术组，模型组大鼠骨组织ClC-3 显著下调（P＜0.05），ENaCα 和NCC 表达无显著变化（P＞0.05），而中高盐饮食摄入则可上调去卵巢大鼠NCC，并下调其骨组织ClC-3 和ENaCα 表达，高盐饮食摄入则下调其NCC 表达水平（P＜0.05）。经补肾复方干预的模型大鼠NCC 表达水平下降，ClC-3 表达水平显著升高，并且与对应的中高盐组、高盐组相比，补肾复方的干预能不同程度下调中高盐、高盐摄入的大鼠骨组织NCC水平，并上调骨组织中ClC-3 和ENaCα 的表达（P＜0.05），说明补肾中药复方能调节离子通道的改变。此外，补肾方+生理盐水组相较于补肾复方组大鼠ENaCα 和NCC 上调，ClC-3 下调（P＜0.05），表明生理盐水对补肾复方作用机制的发挥存在影响。

Figure 4. The protein expression of ENaCα， ClC-3， and NCC in bone tissues of the rats in each group. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs sham group； ‡P＜0.05 vs OVX group； #P＜0.05 vs OVX+BHF group； △P＜0.05 vs OVX+MSD group； ▲P＜0.05 vs OVX+HSD group.图4 各组大鼠骨组织ENaCα、ClC-3和NCC蛋白的表达

讨 论

离子通道对于骨发育和骨稳态至关重要，也是许多药物作用的靶点[11］。近年来，研究发现成骨细胞和破骨细胞上表达多种离子通道如钠通道、氯通道、钙通道和钾通道等，这些离子通道不仅调节骨系细胞的增殖、分化和凋亡等生理活动，还参与多种信号感知、传递及转导过程，影响骨代谢功能，离子通道对骨系细胞的影响日益受到人们的关注[12-13］。ENaC 主要可通过调控细胞内外Na+的转运以维持体内钠离子的平衡，也是许多药物作用研究的重要靶点[14］。Na+已被证实可影响OB 细胞的分化来干预成骨功能，即低浓度时促进分化，而高浓度抑制分化，成骨相关基因、ENaCα mRNA 的变化与OB 细胞分化活性的变化基本一致，ENaC 也参与OB 细胞在压力刺激作用下的信号转导[15］，以调节OB 细胞骨形成能力。本实验也同样发现，在高盐饮食状态下，股骨ENaCα 蛋白表达均下调，可能是抑制成骨细胞分化的一个新途径，从而影响骨代谢的变化。

NCC 也成称为噻嗪类敏感的钠-氯共同转运蛋白，噻嗪类利尿剂药理机制包括促进机体水、钠的排泄，减少血容量、尿钙排泄，促进体内钙平衡，而噻嗪类利尿剂的长期使用被发现可以减少骨折的发生风险、增加骨密度[16］。现代研究还发现此类噻嗪类利尿药可直接抑制NCC 刺激OB 细胞分化标志物Runx2 和骨桥蛋白的产生，提高矿化结节的形成[17］，且NCC基因的失活能提高OB 细胞成骨分化能力以提高骨密度[18］。本实验研究也证实了NCC在骨组织中的表达，且随着体内氯化钠浓度的增加，NCC 的mRNA 和蛋白表达增加，在一定程度上抑制了成骨细胞活性和分化，诱导骨吸收，导致钙从骨中丢失，从而影响骨代谢，而补肾中药复方的干预可调节高盐饮食引起NCC 的mRNA 和蛋白表达的改变，说明补肾中药复方就有一定的治疗效果。ClC-3 氯通道与骨代谢也有密切关系[19］，通过检测ClC-3 在小鼠MC3T3-E1 细胞中的表达，结果表明骨形成标志物ALP、OCN 和Runx2 的mRNA 表达水平与ClC-3 表达水平成正相关，并呈高表达。而RNAi 介导的ClC-3基因沉默可下调这些成骨标志物的表达[20］。在本研究中，随着高盐饮食的增加，ClC-3 蛋白表达量下调，因而推断ClC-3抑制了去卵巢大鼠成骨分化，使骨吸收大于骨形成，从而直接影响骨代谢，补肾方干预后的补肾方+中高盐饮食组和补肾方+高盐饮食组与其相对应的高盐饮食组比较，均可不同程度的调节ClC-3 蛋白表达的改变，说明补肾中药复方的调节作用。此外，《本草纲目》曰：“故服补肾药用盐汤者，咸归肾，引药气入本脏也”，中医学认为，味咸的中药多归肾经，历代医家应用补肾壮骨药物时，也常用盐作为引经之药，本研究纳入的补肾方+生理盐水组研究也为该理论的科学内涵提供了更多依据。

综上所述，高盐饮食可引起股骨组织的相关离子通道ENaCα 和ClC-3 的表达下调，NCC 的表达上调，从而直接影响骨系细胞活性，引起骨形成的减少和骨吸收的增加，改变骨代谢的平衡。同时补肾中药复方干预能够不同程度的调节高盐引起的相关离子通道的改变而发挥药效作用。