中性粒细胞胞外诱捕网浸润促进尿道创伤后尿道成纤维细胞活化和增生性瘢痕形成*

陈烨辉， 许以城， 阮中天， 林婷婷， 薛学义， 许 宁

（福建医科大学附属第一医院泌尿外科，福建 福州 350005）

尿道创伤后狭窄是临床面临的棘手问题之一。创伤后创面过度修复引起尿道组织瘢痕性增生是其发生的主要原因[1］。研究表明，创伤后创面局部炎症过度激活，短期内使组织损伤加剧，创面迁延不愈，长期造成细胞外基质合成与降解失衡，促进瘢痕性增生[2］。对创伤后炎症过程合理调控，避免尿道成纤维细胞过度活化与过多合成胶原，是防止创面过度修复引起瘢痕性增生的重要策略。

中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps， NETs）是一种中性粒细胞在细胞外产生的由组蛋白、DNA 和蛋白酶组成的网状结构。NETs 以DNA 为骨架、其间镶嵌多种蛋白成分，构成DNA-蛋白质复合物[3］。近年研究表明，NETs 参与创伤后炎症过程[4］。此外，NETs 是肾纤维化、硬膜纤维化、动脉粥样硬化等病理过程重要调控因素[5-7］。然而，NETs 对创伤后尿道瘢痕形成及尿道狭窄的发生作用仍未明确。本研究旨在探讨尿道创伤后NETs 对尿道成纤维细胞的作用，及其对尿道瘢痕形成的影响。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

改良型DMEM 培养液和胎牛血清购自购自Sigma；兔来源抗髓过氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）和瓜氨酸组蛋白H3（citrulline histone H3， CitH3）抗体购自Abcam；抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、I 型胶原（collagen type I， collagen I）和GAPDH 抗体均购自Affinity；脱氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I， DNase I）购自Merck；酶联免疫吸附试剂盒购自Hycult Biotech；BCA 蛋白定量试剂盒购自Biosharp；CCK-8试剂盒购自Elabscience。

2 临床样本

20 例2021 年6 月 至2022 年12 月 期 间 于 福 建 医科大学附属第一医院泌尿外科就诊的尿道外伤患者，于创伤后24 h 内获得其尿液与血液样本，其中5例提供创伤后24 h 内的尿道组织样本；20 例无尿道创伤的健康志愿者的尿液与血液样本作为对照；5例作为对照的正常尿道组织取自前列腺增生手术患者；所有病例均需排除既往尿道手术史、合并尿路感染者。标本获取已通过福建医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准（闽医大附一伦理医研[2019］035号），并通过患者及其家属知情同意。

3 细胞来源及培养

从福建医科大学附属第一医院泌尿外科手术病人获取尿道瘢痕组织，参照文献方法提取原代尿道成纤维细胞[8］。细胞于37 ℃、5% CO2、改良型DMEM培养液（含10%胎牛血清）条件下，传代培养4～8 代用于后续实验。标本获取已通过福建医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准，并通过患者及其家属知情同意。

4 主要实验方法

4.1 尿道创伤动物模型 依照既往发表的方法构建动物模型[2］。本研究中动物实验均经福建医科大学实验动物伦理委员会批准（闽医大附一伦理医研[2019］035 号），均符合实验动物保护条例与实验动物福利原则。采用2.5～3.5 kg 白色雄性新西兰兔[普通级，SYXK（闽）2018-0002］，购自福建医科大学动物实验中心。建模步骤如图1D 所示：（1）采用异氟烷持续性吸入麻醉（诱导麻醉浓度5%，维持浓度2.5%～3%）后，取仰卧位，固定四肢及头部，会阴部碘伏消毒铺巾；（2）置入F8 号导尿管引流膀胱内残余的尿液，使用庆大霉素溶液冲洗膀胱，直到膀胱引流液变得清亮，轻轻牵拉阴茎；（3）沿着阴茎腹侧切开，逐层切开暴露尿道，在距离尿道外口0.5～1 cm 处做一条长约0.5 cm 的横切口。直到暴露出尿管，注意避开血管，保持术野清晰；（4）使用4.0 可吸收线逐层间断缝合尿道黏膜和皮肤及皮下组织，缝线固定导尿管，沿着尿道外口0.5 cm处剪断尿管，防止实验兔对尿管的撕咬及尿管滑脱。术后给予口服头孢地尼一周防止感染。构建尿道创伤动物模型完毕后，分组处理如下：非手术对照组、手术+转化生长因子β1（transforming growth factor β1， TGF-β1）注射（阳性对照）组、手术+生理盐水注射组、手术+DNase I 溶液注射组，干预药物均在术后即刻尿道局部注射，术后12、24、48、72 h 检测尿液中NETs 含量变化；2 个月后取尿道组织行Masson染色，检测胶原纤维含量，评估瘢痕形成情况。

Figure 1. The level of NETs increased after urethral trauma. A： there was no statistically significant difference in the level of NETs in the blood between patients who had sustained urethral trauma （n=20） and healthy controls （n=20）； B： the level of NETs in the urine of patients who had sustained urethral trauma （n=20） was higher than that of healthy controls （n=20）. C： immunofluorescence microscopy images of NETs showed that samples from animals with urethral trauma （n=5） had a higher level of NETs than samples from the controls （n=5）. Blue： DAPI， Red： CitH3， Green： MPO. Scale bar=200 μm； D： the process of constructing the animal model of urethral trauma. Scale bar=1 cm； E： the level of NETs in the urine collected at various time points from animals with urethral trauma （n=20）. Mean±SD. *P＜0.05 vs control group.图1 尿道创伤后NETs水平升高

4.2 人血中性粒细胞提取与NETs 的诱导 依照前人发表的方法提取中性粒细胞并体外诱导NETs[9］。取外周血，于无菌条件下加入1∶3 的红细胞裂解液，混匀后室温静置15 min，250×g离心5 min 后，吸取上清，再次重复裂解红细胞，留管底白细胞，加入含1%BSA 的PBS 液2 mL，充分混匀后加于预置4 mL 60%Percoll 的离心管液面上，500×g离心20 min。留管底中性粒细胞，用含有1% BSA 的PBS 洗2 次，获中性粒细胞待用。佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate， PMA）是经典的NETs 刺激剂，用25 nmol/L 的PMA 刺激中性粒细胞2 h后，获得NETs。

4.3 NETs 水平测定 采用酶联免疫吸附法检测NETs 中的MPO-DNA 复合物，以此对可溶性NETs 进行定量检测[10］。用MPO抗体包被96孔板并在4 ℃过夜，充分洗涤后以1% BSA 封闭1 h。将样本加入板中孵育1 h 后洗涤。随后加入抗DNA-HRP 抗体孵育2 h。充分洗涤后加入100 μL 过氧化酶底物。随后加入硫酸溶液终止反应并于450 nm波长下读取吸光度（A）值。

4.4 Westen blot 提取总蛋白后，BCA 法测定蛋白浓度。配置分离胶和浓缩胶，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温下封闭处理2 h，浸于Ⅰ抗溶液中4 ℃孵育过夜，再浸于Ⅱ抗溶液中孵育30 min，PBS洗涤后显影曝光。

4.5 CCK-8 实验 将转染24 h 细胞按照每孔1×103个的密度接种到96 孔板中，设置3 个复孔。在培养不同时间点（24 h、48 h 和72 h）将每个孔的培养液替换为含有10%的CCK-8试剂的等量新鲜培养液。继续培养2 h 后，测定各孔在450 nm 波长的吸光度（A）值，绘制细胞活力曲线。

4.6 免疫荧光染色 组织标本以抗MPO 和抗CitH3 共染色区域占比，以显示并定量NETs。切片并进行抗原修复后，加入抗MPO 和抗CitH3，于4 ℃下孵育过夜。充分洗涤后加入Ⅱ抗孵育30 min，洗涤后加入DAPI 避光孵育5 min，再次洗涤。封片后采集图像。

4.7 Masson 染色与分析 石蜡切片脱蜡、蒸馏水洗，Weigert苏木精液染5～10 min，充分水洗。用Masson 丽春红酸性复红液染5～10 min。以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷钼酸水溶液分化3～5 min 后，用苯胺蓝染5 min。以0.2%冰醋酸溶液浸洗片刻，依次95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。ImageJ 软件分析图像中染为蓝色的胶原纤维部分所占组织面积的比例，以此定量组织纤维化程度。

5 统计学处理

应用SPSS 22.0 统计软件分析，结果采用均数±标准差（mean±SD）表示。两组和多组间比较分别采用t检验和单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 尿道创伤后NETs水平升高

为明确NETs是否受尿道创伤影响，分别对20例尿道创伤患者和20 例健康对照组志愿者采取外周血和尿液标本，并检测NETs 含量。结果显示，外周血中NETs含量两组无显著差异（P＞0.05），且均处于较低水平（图1A）；尿道创伤患者的尿液NETs 水平显著高于对照组志愿者（P＜0.05）（图1B）。对两组患者尿道组织行免疫荧光染色鉴定NETs 水平，结果显示尿道创伤组中组织NETs 水平显著高于对照组（P＜0.05）（图1C）。用新西兰兔建立尿道创伤动物模型，在手术后不同时间点采集尿液，检测NETs 水平变化趋势。如图1E所示，NETs在尿道创伤后早期阶段，NETs 水平逐渐升高，24 h 左右处于峰值，随后缓慢下降。

2 尿道创伤后NETs 水平越高，尿道瘢痕纤维化程度越高

为明确尿道创伤后NETs 水平升高是否参与尿道狭窄的形成，构建新西兰兔尿道创伤模型，取术后24 h 尿液检测NETs 水平，以＜0.5 mg/L、0.5～0.75 mg/L、＞0.75 mg/L 为标准，分为+、++、+++三组；2 个月后取尿道组织行Masson染色，检测胶原纤维含量，评估瘢痕形成情况。如图2 显示，NETs 水平越高的分组，后续尿道组织胶原纤维含量越高，+++组比++组、++组比+组差异均有统计学意义（P＜0.05）。

Figure 2. The urethral scar became more severe as the level of NETs increased. A： representative images of Masson staining of collagen fibrosis in urethral tissue sections from rabbits of various groups. The blue-stained collagen fibers became denser as the level of NETs increased. Scale bar=100 μm. B： quantification of fibrotic area of urethral tissue from rabbits from various groups. Mean±SD. *P＜0.05 vs NETs（+） group； #P＜0.05 vs NETs（++） group.图2 尿道创伤后NETs水平越高，尿道瘢痕纤维化程度越高

3 NETs促进尿道成纤维细胞活力与胶原合成

从人尿道组织中原代提取尿道成纤维细胞，如图3A 所示，蓝色荧光细胞核周围分布密集条索状的绿色荧光为α-SMA，即表明分离所得细胞确为尿道成纤维细胞。随后，收集制备所得的NETs，免疫荧光染色显示，绿色荧光（MPO）与红色荧光（CitH3）重叠的梭形或条索状结构为NETs（图3B），用于后续实验。分别加入0.1 mL 体积的生理盐水、0.5 mg/L 的NETs（+）、1.5 mg/L 的NETs（++）溶液干预尿道成纤维细胞，以CCK-8 实验评估其对细胞活力的影响。结果如图3C 显示，NETs 增强成纤维细胞活力（P＜0.05），且作用随着NETs浓度升高而增强（P＜0.05）。同样，划痕实验也显示，NETs 促进成纤维细胞迁移（P＜0.05），且作用随着NETs 浓度升高而增强（P＜0.05，图3D）。此外，NETs 还促进α-SMA 与胶原纤维I 蛋白的表达（P＜0.05），且作用随着NETs 浓度升高，其促进作用增强（P＜0.05，图3E）。

Figure 3. NETs promoted activation of urethral fibroblasts and synthesis of collagen. A： immunofluorescence microscopy images of urethral fibroblasts. Blue： DAPI； green： α-SMA. Scale bar=30 μm. B： detection of NET formation by immunofluorescence in neutrophils treated with PMA. Blue： DAPI； green： MPO； red： CitH3. Scale bar = 200 μm. C： as the level of NETs increased， the cell viability of urethral fibroblasts was enhanced； this was detected by the CCK-8 assay at 450 nm.D： as the level of NETs increased， the migration ability of urethral fibroblasts was enhanced； this was detected by the wound healing assay. Scale bar=100 μm. E： as the level of NETs increased， the α-SMA and collagen I expression in urethral fibroblasts was enhanced； this was detected by Western blot analysis. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs NETs （+） group.图3 NETs促进尿道成纤维细胞活化与胶原合成

4 DNase I 降低尿道创伤后NETs 水平和尿道瘢痕形成

进一步探索DNase I 是否能在动物水平拮抗NETs 对尿道瘢痕形成的作用。结果如图4A 所示，DNase I 处理能显著抑制手术引起的NETs 水平升高（P＜0.05）。2 个月后取尿道组织行Masson 染色，检测胶原纤维含量，评估瘢痕形成情况。结果显示，DNase I 处理显著减少尿道组织中胶原纤维的含量（P＜0.05，图4B）。此外，Western blot 检测显示DNase I处理显著降低尿道瘢痕组织中α-SMA与胶原蛋白I的蛋白表达水平（P＜0.05，图4C）。

Figure 4. DNase I reduced the level of NETs and suppressed the formation of urethral scar formation. A： levels of NETs in the urine collected at various time points from animals of various groups. B： Masson staining of collagen fibrosis from rabbits of various groups. The blue-stained collagen fibers became shorter and more loosely arranged when treated with DNase I. Scale bar=100 μm. C： α-SMA and collagen I expression was induced during treatment with DNase I. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs operation group.图4 DNase I降低NETs水平并抑制尿道瘢痕形成

讨 论

尿道创伤是尿道狭窄的常见病因，导致不同程度排尿困难，严重者影响肾功能[11］。手术治疗是主要的治疗方式。尿道内切开手术操作简便、微创、术后恢复快，但远期疗效欠佳，术后尿道再狭窄发生率高；开放性修复重建手术效果较好，但手术创伤较大、技术难度较高，也仍有术后复发的可能[12-13］。局部使用曲安奈德、紫杉醇、丝裂霉素C 等可减少尿道瘢痕形成[14-16］；我们既往研究也显示Rho 激酶抑制剂、间充质干细胞等对尿道狭窄的预防具有一定效果[8，17］。但由于尿道创伤后修复及瘢痕形成机制未完全阐明，部分患者仍难取得满意疗效，术后出现狭窄复发。

尿道创伤后早期，受损组织与坏死细胞激活炎症反应，趋化中性粒细胞聚集损伤区域[18］。中性粒细胞一方面分泌TNF-α、IL-1β 和IL-6 等扩大炎症反应，一方面释放蛋白酶清理坏死组织[19］。中性粒细胞是创伤后炎症反应主要“执行者”。NETs 是中性粒细胞受某些因素刺激后，形成的以去聚化染色体DNA 为骨架、镶嵌多种蛋白及细胞因子的网状结构[20］。研究表明，NETs 在创伤后纤维修复过程中发挥重要调控作用[21］。Frangou 等[22］研究显示在系统性红斑狼疮中，应激反应蛋白REDD1 与自噬介导NETs 形成，NETs 通过释放组织因子和IL-17A，促进靶器官纤维化。Sukuki 等[23］研究表明NETs 是肺纤维化重要致病环节，模型小鼠PAD4基因敲除，能显著减轻博来霉素诱导的肺纤维化。Hofbauer 等[24］报道NETs 过度生成是心梗后心室纤维化重构的重要原因。然而NETs 在尿道瘢痕形成过程中的作用既往仍未有研究阐明。本研究显示，尿道创伤后，血液未检测到NETs 水平升高，而尿液中则出现NETs 显著升高，这表明NETs 改变仅局限于尿道创面局部，而并非全身性改变。研究结果还提示，这一现象与后期创面增生性瘢痕的纤维化程度可能密切相关。体外实验进一步揭示NETs 促进尿道成纤维细胞活化与胶原合成可能是其内在机制。因此，NETs 可能是干预尿道瘢痕形成的一个潜在治疗靶点。脱氧核糖核酸酶是NETs 有效的降解剂，并能明显拮抗其作用[25］。在动物模型中DNase I 局部注射显著抑制尿道瘢痕形成，这也初步证实此靶点的有效性。本研究存在一定不足之处，仅在细胞及动物模型层面初步验证了NETs 对尿道成纤维细胞活化及瘢痕形成的影响；然而，NETs 作为一个携带多种分子的DNA-蛋白质的网状结构，究竟是其中的何种信号分子对下游表型起作用？具体的信号传导途径和细胞机制是什么？仍需进一步研究。

综上所述，本研究证明NETs 通过促进尿道成纤维细胞的活化与胶原合成，参与尿道创伤后创面修复与瘢痕增生的调控过程。DNase I 可抑制NETs 生成，从而减轻尿道增生性瘢痕。这或可为治疗创伤后尿道狭窄提供参考。