紫檀芪和白藜芦醇对Aβ25-35 诱导神经损伤的保护作用及机制研究

闫秋颖，张晓然，刘思远，郭轩桐，杨浩然，朱 琳

（沈阳医学院基础医学院•辽宁 沈阳•110034）

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征为β 淀粉样蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)沉积及Tau 蛋白过度磷酸化，并导致神经细胞丢失。线粒体分裂和融合之间的动态平衡对于维持线粒体形状和功能至关重要。研究证实，线粒体分裂融合异常可引起细胞凋亡并导致细胞丢失[1]。

芪类是具有生物活性的天然产物，主要以白藜芦醇及其在葡萄中发现的衍生物紫檀芪为代表[2]。研究发现，白藜芦醇通过抑制AD 模型小鼠细胞凋亡发挥神经保护作用[3]。紫檀芪为白藜芦醇的衍生物，具有更好的脂溶性和生物利用度[4]。本研究主要考察了紫檀芪和白藜芦醇的神经保护作用及其可能的作用机制，以阐明它们在AD 治疗中的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 动物造模与分组

昆明雄性小鼠(18～25 g)，购自辽宁长生生物技术股份有限公司,动物生产使用许可证号: SCXK(辽)–2015–0001。动物实验经沈阳医学院实验动物伦理委员会(SYYXY2019050801)批准。侧脑室注射3μL (含9nmol)聚集态Aβ25-35进行造模。将小鼠随机分为对照组、模型组、紫檀芪组(40mg•kg-1)和白藜芦醇组(40mg•kg-1)，实验流程如图1A。

图1 紫檀芪和白藜芦醇对小鼠新物体辨别实验的影响

1.2 新物体辨别实验

新物体辨别实验分为适应阶段和测试阶段。适应阶段：在灌胃第5d 时，将小鼠放于开放场内，让其自由探索5min，以适应环境。第6d 进行测试（包括训练和检测阶段）。训练阶段：记录小鼠5min 内自由探索物体的时间(tA1、tA2)。检测阶段：间隔1 h 后，将物体A2 换成形状、材质、颜色等完全不同的新物体B，记录小鼠5min 内自由探索不同物体的时间(tA1、tB)。优先指数=tA2/(tA1+tA2)×100%or tB/(tA1+tB)×100%。

图2 紫檀芪和白藜芦醇对小鼠神经细胞保护的影响

图3 紫檀芪和白藜芦醇对小鼠神经细胞凋亡的影响

1.3 免疫荧光实验

将冰冻切片室温复温10min，滴加0.3% TritonX–100 室温孵育30min，10%山羊血清封闭液37°C 孵育60min，滴加兔抗NeuN 抗体后4°C 孵育过夜。滴加山羊抗兔IgG-Cy3 二抗(1∶500)，封片，荧光显微镜观察。

1.4 透射电镜实验

小鼠麻醉后完全暴露心脏，用生理盐水进行灌流后灌入灌流液(4%多聚甲醛∶2.5%戊二醛=1∶1)。取小块皮层组织，加入1%锇酸固定2 h，漂洗后乙醇脱水，用Epon812 对组织浸透聚合包埋，醋酸铀-柠檬酸铅双染后透射电镜拍照。

1.5 Westernblot 实验

将小鼠皮层组织均浆，取30μg 进行SDS 聚丙烯凝胶电泳。加入兔抗NeuN，小鼠抗β-actin,兔抗Bcl-2 或Bax 抗体，4°C 孵育过夜。加入山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG 抗体(1∶10000)室温孵育2h，采用ECL 发光试剂盒进行显色。

1.6 Real-time RT-PCR 实验

利用Trizol 试剂提取皮质组织总RNA，逆转录反应获得cDNA。利用SYBR Green 试剂盒以GAPDH 作为内参进行real-time RT-PCR 反应。PCR 反应条件：95℃30 s；52℃30 s；72℃60 s，共40 个循环，使用2-△△Ct方法计算每组之间相对mRNA 的表达。

1.7 统计学分析

实验数据使用SPSS26.0 软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(mean ± SD)表示，不同组间采用单因素方差(one-way ANOVA)分析检测数据，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 紫檀芪和白藜芦醇对AD 模型小鼠形象辨别能力的影响

研究发现，各组小鼠对物体的探索总时间无显著差异。在训练阶段，各组小鼠对物体A2 的优先指数无显著差异。与模型组相比，给药后均可显著提高小鼠检测阶段的新物体辨别优先指数。

2.2 紫檀芪和白藜芦醇对AD 模型小鼠神经细胞保护的影响

与对照组相比，模型组小鼠皮层NeuN 荧光强度和蛋白质水平显著降低。与模型组相比，给药后小鼠NeuN 荧光强度和蛋白质水平均增加。详见图2。

2.3 紫檀芪和白藜芦醇对AD 模型小鼠神经细胞凋亡的影响

与对照组相比，模型组小鼠神经细胞核出现固缩，染色质向核膜边聚集呈块状，同时凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax 显著降低。给药后可逆转上述神经细胞核形态，增加Bcl-2/Bax 蛋白表达，详见图3。

2.4 紫檀芪和白藜芦醇对AD 模型小鼠线粒体动力学的影响

与对照组相比，模型组小鼠皮层组织Drp1、Opa1和MFN1 基因的mRNA 水平显著降低。紫檀芪或白藜芦醇处理可分别显著增加线粒体分裂基因Drp1 和融合基因Opa1 的mRNA 水平，详见图4。

图4 紫檀芪和白藜芦醇对小鼠线粒体分裂融合相关基因的影响

3 讨论

白藜芦醇作为天然的芪类衍生物受到广泛的关注，在缺血性脑损伤、学习记忆及抗肿瘤等方面均发挥重要作用。紫檀芪为白藜芦醇的甲基化衍生物，具有抗肿瘤、抗氧化和抑菌等多种生物活性，且具有更高的生物利用度[4,5]。因此，白藜芦醇和紫檀芪在AD中的作用值得深入研究。

线粒体上的Bcl-2 家族蛋白由促存活和促凋亡成员组成，可决定细胞生存或死亡。研究发现，紫檀芪和白藜芦醇改善了Aβ25-35诱导的AD 模型小鼠学习记忆障碍，增加皮层神经细胞量。同时，改善神经细胞核的形态，上调Bcl-2/Bax 蛋白表达，抑制神经细胞凋亡。研究证实，紫檀芪处理后主要增加AD 模型小鼠线粒体分裂基因Drp1 表达，而白藜芦醇主要增加融合基因Opa1 表达。

综上所述，紫檀芪和白藜芦醇通过调节线粒体动态平衡抑制细胞凋亡，改善AD 模型小鼠学习记忆障碍。同时，本研究还证实紫檀芪和白藜芦醇的保护机制可能分别与调节线粒体分裂和融合相关基因有关，为防治AD 的新药开发提供了理论依据。