基于网络药理学探讨虎眼万年青治疗癌症的作用机制

张 雪，邸可心，岳显文，赵雪亮，张佳琪，徐 阳

（白城医学高等专科学校药学院•吉林 白城•137000）

虎眼万年青系多年生百合科草本植物，原产于非洲南部，目前在我国吉林省广泛种植。虎眼万年青作为一种中药，具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力等功能[1]。近年来研究发现，其免疫调节、镇痛与抗炎效果明显，其抗癌活性尤为突出，具有超过10 种抗肿瘤活性成分，其中虎眼万年青皂苷(OSW-1) 的抗肿瘤活性是常见抗癌药物喜树碱、阿霉素、紫杉醇活性的10～100 倍[2]。通过试验证实，其使用后的病变组织靶点作用明显，细胞毒性和致突变性研究结果显示，对机体无较大损伤，说明其安全性较高，应用前景十分广阔，值得进一步研究开发利用。

癌症亦称恶性肿瘤,是由于控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病,癌症是威胁人类生命健康的三大疾病之一,全球范围内最主要的健康问题之一，具有较高的发病率、病死率。因为我国庞大的人口基数，癌症新发病例数和死亡人数都明显高于其他国家,给患者家庭和医疗保障系统带来了极大的负担[3]。近年来,利用中医药治疗癌症已成为临床研究热点。中药的作用是提高癌症患者的自身免疫力,从而达到抑制癌细胞增殖及杀死癌细胞的目的，具有疗效好、低毒性、药源广等优势[4]。目前，网络药理学技术被广泛应用于中药研究，从整体上阐释中药防治疾病的药效活性成分和作用靶点。本文通过网络药理学预测虎眼万年青治疗癌症的潜在化合物、靶点及作用通路，建立了“成分-靶点-通路”网络，以揭示其药效成分、作用靶点及作用机理，为虎眼万年青的研究开发与应用提供依据[5]。

1 资料与方法

1.1 虎眼万年青化学成分筛选及靶点预测

将目前已知虎眼万年青的成分进行收集，并将结构式输入SwissADME 数据库中进行分析，筛选出胃肠吸收率高、类药性强的成分进行靶点预测。将待预测成分导入Swiss Target Prediction，点击Predict targets 进行分析，输出化合物靶点信息[6]。下载Uniport最新数据库，选择物种为“Homo Sapiens”，将预测出的目标靶点与Uniprot 数据库中搜索人类基因蛋白进行匹配，得到虎眼万年青主要活性成分的潜在靶点。

1.2 癌症靶点的收集

以“癌症”的英文名“Cancer”为关键词，分别在OMIM、GeneCards 和DrugBank 数据库中查找Cancer的靶点，整合3 个资料库的查询结果，对数据进行批量标准化[7]，同样与Uniprot 数据库中的人类基因蛋白进行匹配，得到的靶点即为可用于治疗Cancer 的相关靶点。将活性成分的预测靶点与Cancer 的相关靶点进行对比，最终可得到虎眼万年青中治疗癌症的潜在活性成分及其靶点信息，根据所得信息绘制韦恩图。

1.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建

将虎眼万年青治疗癌症的潜在靶点输入String数据库，选择“Multiple protein”，物种选择为“人源”，得到蛋白相互作用关系，导出PNG 图片及数据表，通过Cytoscape 构建网络图[8]。

1.4 GO 功能与模块分析、KEGG 富集通路分析

将筛选出的虎眼万年青活性成分靶点与癌症靶点的交集，输入Metascape 数据进行GO 富集分析（Gene Ontology）和通路富集分析（KEGG）[9]，其中GO富集分析包括生物学过程（Biological Process，BP）、细胞定位（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF），各自描述了基因产物可能行使的分子功能，所处的细胞环境，参与的生物学过程。对所得数据进行分析和整理，并使用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）制备富集分析气泡图。

1.5 虎眼万年青提取物活性成分-靶点-通路网络构建

采用Cytoscape 3.7.0 软件中的Merge 功能，构建虎眼万年青提取物活性成分-靶点-通路网络图。其中，节点代表活性成分、靶点和信号通路，边用来连接活性成分、靶点和信号通路[10]。

2 结果

2.1 虎眼万年青主要化学成分

通过查阅中药数据库得到虎眼万年青活性成分25 种，主要包括山奈酚、甲酸辛酯、9，12-十八碳二烯酸、大黄素甲醚、汉黄芩素等，详见表1。

表1 虎眼万年青的活性成分

2.2 癌症疾病靶点

将所有成分导入SwissADME 数据库进行靶点预测，并与Uniprot 数据库中的人类基因靶点进行匹配，得到1098 个活性成分靶点，去重后最终为430 个靶点。通过GeneCards、OMIM、DrugBank 三个数据库对Cancer 进行靶点预测，合并后删除重复项得到相关靶点670 个，与Uniport 数据库匹配后最终保留476 个Cancer 潜在作用靶点[11]。将虎眼万年青的作用靶点和Cancer 的相关靶点进行交集映射，绘制韦恩图（图1），共得到74 个虎眼万年青潜在治疗Cancer 的靶点，详见表2。

图1 虎眼万年青-癌症靶点韦恩图

表2 虎眼万年青-癌症交集靶点

2.3 蛋白-蛋白相互作用网络构建

使用STRING 数据库在线分析目标的相互作用，得出了节点74 个、边874 条的PPI 网络[12]，详见图2。导出PPI 网络数据，利用Cytoscape3.7.0 软件按照度量值对其进行结构特性的分析构建靶点网络图，详见图3。节点代表蛋白，边代表蛋白之间的关系，节点的大小、颜色反映其度值的大小，节点越大相应的度值越大，颜色由黄变红相应的度值则由小变大，边的粗细反映着连接评分，边越粗，评分越高。这些度值较大的蛋白质在整个网络中起着关键的作用，同时这些蛋白所对应的靶点在虎眼万年青治疗癌症中处于重要的地位，可能是虎眼万年青抗癌的关键靶点[13]。度值排名在前颜色越深的靶点，蛋白质基因之间的联系愈密切。图中间为排名前十的靶点，这些高分度的蛋白质在虎眼万年青抗癌中扮演着重要角色，可能成为虎眼万年青抗癌的关键靶标，基本信息见表3。

图2 PPI 网络图

图3 交集靶点网络图

表3 关键靶点的基本信息

2.4 GO 和KEGG 富集分析

利用Metascape 数据库进行GO 富集分析和KEGG 通路分析，得到生物学过程（BP）1039 个条目，细胞组成（CC）70 个条目，分子功能（MF）109 个条目。在GO 分析条目中，分别选取BP、CC、MF 中显著性排名前10 的功能信息绘制柱状图（图4）[14]。分析得到的BP 主要涉及蛋白质磷酸化、对荷尔蒙的反应、酶联受体蛋白信号通路、磷酸化的正调节、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、激酶活性的调节、细胞迁移的正调节、细胞运动的正调节、移动的正调节、蛋白质磷酸化的正调节；CC 主要涉及受体复合物、神经元细胞体、细胞体、转移含磷基团的转移酶复合物、中心体、薄膜筏、膜微区、焦点粘连、细胞-基质结、线粒体膜；MF 主要涉及激酶活性、蛋白激酶活性、乙醇基为受体磷酸转移酶活性、激酶结合、蛋白激酶结合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白质同源二聚活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、转录因子结合、蛋白质结构域特异性结合。

图4 虎眼万年青治疗癌症靶点的GO 功能富集分析

KEGG 富集分析结果得到153 条相关通路，通路富集分析结果按照P 值从小到大排序，取前20 条通路绘制KEGG 气泡图（图5）。可知所参与的生物学过程核心信号通路主要为癌症的途径、PI3K-Akt 信号通路、前列腺癌症、局部粘连、Ras 信号通路、癌症中的微RNA、化学致癌-受体激活、脂质与动脉粥样硬化、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、内分泌抗药性；表4 展示了核心通路具体信息[15]。将前十条核心通路及通路靶点上传至Cytoscape 软件中，构建信号通路-靶点的网络图（图6）。

图5 KEGG 通路富集分析气泡图

图6 KEGG 通路-靶点网络图

表4 KEGG 核心信号通路的基本信息

2.5 虎眼万年青提取物活性成分-靶点-通路网络构建

按照“1.5”项下的方法构建虎眼万年青活性成分-靶点-通路网络（图7），该网络图上下为KEGG 核心信号通路，左右两侧为虎眼万年青活性成分，共有97 个节点，包括13 种成分、74 个靶点、10 条通路和275 条边，节点越大，说明度值越大，与其相连的节点数越多。其中山奈酚、大黄素甲醚、9,12-十八碳二烯酸、汉黄芩素、甲酸辛酯等度值较大，表明是抗癌的重要活性成分。另外，靶点节点越大，靶点度值越大，与其相连的成分越多，图中PIK3R1、MAPK1、BCL2、EGFR、MAP2K1 等靶点节点较大，可能是虎眼万年青发挥抗癌作用的重要靶点[16]。

图7 成分-靶点-通路网络图

3 讨论

近年来，通过网络药理学方法研究肿瘤疾病的“药物-靶点-疾病”网络已经取得了初步进展，中医药主要通过抑制肿瘤细胞增殖，诱导细胞自噬和凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭和迁移，调节机体免疫功能，抑制肿瘤血管生成以及调节肿瘤微环境等途径起到治疗作用。此外，网络药理学还可以结合代谢组学、基因组学和转录组学等研究方法提高结果的可靠性，为阐明肿瘤发病机制，从分子水平揭示疾病本质以及中药防治恶性肿瘤的多靶点多通路网络效应机制提供可靠依据[17]。

本研究利用网络药理学方法，筛选分析得到25个活性成分以及430 个靶点，与癌症的476 个直接靶点进行相互映射，得到共同靶点74 个，再将这74 个共同靶点进行GO 和KEGG 通路富集分析，获得生物学过程（BP）1039 个条目，细胞组成（CC）70 个条目，分子功能（MF）109 个条目，153 条相关通路。其中核心通路10 条，共有55 个活性组分可以作用于这10条相关信号通路。通过构建PPI 网络，筛选出度值排名前5 的蛋白基因为PIK3R1、MAPK1、BCL2、EGFR、MAP2K1。这些度值较大的蛋白基因可能是虎眼万年青治疗癌症的关键靶点，将其结合KEGG 通路进行分析，说明虎眼万年青可能通过以下途径抑制癌症：表皮生长因子受体EGFR 是一种酪氨酸激酶受体，又称ErbB1，家族中还有其他三个成员，分别是HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3）和HER4 (ErbB4)，几乎在所有上皮组织中都有表达[18]。它的不当激活在几种类型的癌症中起着重要作用，激活EGFR 的配体导致受体酪氨酸激酶磷酸化，激活一些重要的信号通路，如PLCPKC，JAK-STAT，SRC-STAT，Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/ERK 和PI3K/Akt 信号通路共同调节细胞增殖。其中最经典的两条信号通路分别是PI3K/AKT 信号通路以及Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路，这两条信号通路协同控制细胞增殖。在T 细胞中参与T 细胞激活、增殖、迁移以及抑制细胞凋亡等过程，对肝细胞癌、肺癌、乳腺癌等的发展和肿瘤发生至关重要。Ras/Raf/MEK/ERK(MAPK)信号级联是细胞间和细胞内通信必不可少的信号，它调节细胞的基本功能，如生长、生存和分化[19]。

PI3K/AKT 信号通路是EGFR 下游与癌细胞存活相关的信号通路，能够抑制细胞凋亡，促进细胞恶性转化，调节细胞增殖，降低宿主的抗肿瘤能力等[20]。通过ErbB 受体激活PI3K 可以刺激Akt 活性，从而保护细胞免受凋亡。此外，在癌细胞中Akt 的激活与TRAIL/APO-2L(TNF 相关凋亡诱导配体）诱导的凋亡增加被抑制有关。TRAIL/APO-2L 是TNF 超家族成员之一，已被证明具有选择性的抗肿瘤活性。在免疫细胞中，PI3K 控制免疫细胞发育、分化和功能。p110y和pl106 是Ⅰ类P3K 的主要亚型，在免疫细胞受体参与后产生PI (3,4,5）P3。而PI3K/AKT 通路在免疫系统细胞中如中性粒细胞、B 细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T 细胞等发挥重要作用[21]。PI3K/AKT/mTOR 信号通路是多种肿瘤发生、进展中的常见通路，为癌症治疗提供了多个靶点，PI3K/AKT/mTOR 抑制剂主要在乳腺癌、B 淋巴细胞恶性肿瘤方面具有广泛的抑制作用。目前，部分PI3K 抑制剂、mTOR 抑制剂已获FDA批准用于乳腺癌的临床治疗，PI3K,AKT,mTOR,PI3K/mTOR 双靶向抑制剂均已进入B 淋巴细胞恶性肿瘤临床研究阶段[22]。

网络药理学研究分析结果，体现了中医药治疗疾病的系统性、整体性、多靶点、多途径、多成分的优势。在治疗疾病过程中，同一有效成分可以激活不同的信号通路和靶点，不同的有效成分也可以激活同一靶点，从而起到治疗作用，这对中医的异病同治、同病异治的作用机制进行了科学客观的解释。