虫草素及其代谢物3′-脱氧肌苷在大鼠体内的药动学*

胡楠,蒋振伟,钱敏燕,张雯婷,陈陆俊,郑晓,应汉杰,蒋敬庭

(1.苏州大学附属第三医院药学部,常州 213000;2.苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心,常州 213000;3.南京工业大学生物与制药工程学院,南京 211816)

虫草素(cordycepin,Cor)又称3-脱氧腺苷,是蛹虫草的主要活性成分,是从真菌分离出的第一个核苷类抗生素[1]。作为一种腺苷衍生物,虫草素具有降糖降脂、保护神经、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化和调节免疫、抗肿瘤等多种药理作用[2-3]。虫草素可通过嘌呤核苷代谢途径,在腺苷脱氨酶催化作用下快速脱氨形成代谢产物3′-脱氧肌苷(3′-deoxyinosine,3′-Deo)[4]。虫草素及代谢物的化学结构式见图1。虫草素的快速脱氨使其在体内半衰期短,清除率高。因此,虫草素无论是口服还是静脉注射给药,在体内的暴露量都非常少。有研究报道,灌胃给药后大鼠全血样品中未检测到虫草素原型药物,大鼠静脉给予虫草素后在体内半衰期仅1.6 min[5-6]。虫草素发挥疗效的物质基础目前尚未明确,且由于样本采集以及分析方法局限性,限制了对虫草素在体内代谢过程的客观评估和宏观认识。因此,笔者在本研究建立一种同时测定大鼠血浆虫草素及3′-Deo浓度的液相色谱-串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法,并应用于药动学研究。

图1 虫草素(Cor)、3′-脱氧肌苷(3′-Deo)和内标2-氯腺苷(2-Chl)的结构式

1 材料与方法

1.1仪器 Jasper高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪、Triple Quad 4500MD三重四极杆串联质谱仪(上海爱博才思分析仪器贸易有限公司),Vortex-Genie 2涡旋混合器(美国英思科公司),5417R低温高速离心机(艾本德中国有限公司),Direct-Q纯水仪(密理博中国有限公司),BT25S电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司,感量:0.01 mg)。

1.2试剂 虫草素对照品(南京生命原健康科技有限公司,含量:94%,批号:SC11332019200201);3′-Deo(中国食品药品检定研究院,批号:140813-201501);内标2-氯腺苷(2-chloadenosine,2-Chl,阿拉丁公司,批号:B2212295,含量:99%);甲醇(Merck公司,色谱纯);乙酸铵(Sigma-Aldrich公司,分析纯)。

1.3实验动物 雄性SD大鼠[常州卡文斯实验动物有限公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK (苏)2021-0013,实验动物合格证号:202111743]。

1.4方法

1.4.1色谱条件 Kinetex C18(3 mm×100 mm,2.6 μm)(Phenomenex,USA),流动相A:水(5 mmol·L-1乙酸铵),流动相B:甲醇。梯度洗脱,流动相A和B比例:0～0.5 min,95：5;0.5～2 min,25：75;2～3.5 min,25：75;3.5～3.7 min,5：95;3.7～5.2 min,5：95;5.2～5.3 min,95：5;5.3～6 min,95：5。流速:0.45 mL·min-1,柱温40 ℃。

1.4.2质谱条件 电喷雾离子源(electron spray ionization,ESI)正离子检测模式,多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描。虫草素、3′-Deo和2-Chl选用离子对、去簇电压和碰撞电压分别为虫草素:m/z 252.2→136.2,88 V和22 V;3′-Deo:m/z253.2→137.1,40 V和21 V;内标2-Chl:m/z302.1→170.1,50 V和24 V。

1.4.3标准品储备液的配制 精密称取虫草素10 mg,3′-Deo 10 mg,2-Chl 5 mg,分别加入适量甲醇溶解,配制成虫草素、3′-Deo和2-Chl浓度分别为1、2、1 mg·mL-1的标准品储备液。

1.4.4血浆样品的处理 取血浆50 μL,加入含有内标2-Chl(10 ng·mL-1)的甲醇溶液150 μL沉淀蛋白,涡旋震荡3 min,16 400 r·min-1离心10 min (r=8.8 cm),取上清液100 μL,加超纯水100 μL,涡旋30 s,16 400 r·min-1离心10 min (r=8.8 cm),取上清液进样。

1.4.5方法学验证 ①专属性实验 取不同来源大鼠空白血浆6份、加入待测药物对照品的大鼠血浆样品、用药后血浆样品,按照“1.4.4节”方法处理分析。

②标准曲线和定量下限 精密量取虫草素与3′-Deo储备液适量,加甲醇溶液梯度稀释成分别含虫草素5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng·mL-1,3′-Deo10、20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng·mL-1标准系列工作溶液。取工作液5 μL,加空白血浆45 μL,配成相当于虫草素0.5、1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1,3′-Deo1、2、5、10、20、50、100、200 ng·mL-1的标准曲线。按照“1.4.4节”方法处理。以待测物与内标物峰面积比为纵坐标(Y)、待测物浓度 (ng·mL-1)为横坐标(X),以加权(W=1/X2)最小二乘法进行线性回归运算。

③精密度与准确度 取标准品储备液加入空白血浆,配制成分别含虫草素和3′-Deo低、中、高浓度的质量控制(quality control,QC)样本,其中虫草素浓度分别为1.5、7.5和75 ng·mL-1,3′-Deo浓度分别为2.5、20和160 ng·mL-1。按照“1.4.4节”方法处理,每个浓度取6份,在2周内测定3次。根据当天标准曲线计算QC样品浓度,得到批内和批间精密度、准确度。

④提取回收率和基质效应 按“精密度与准确度”项下制备虫草素和3′-Deo各3个浓度QC样本,按照“1.4.4节”方法处理、进样,测得待测物峰面积比值A1。取空白血浆进行预处理,分别取上清液加入相应低、中、高浓度标准溶液,每个浓度6份,测得待测物峰面积比(A2),提取回收率(%)=A1/A2×100%。取纯化水代替空白血浆进行上述操作,制备基质效应考察样本,测得待测物峰面积比(A3),基质效应(%)=A2/A3×100%。

⑤稳定性实验 按“精密度与准确度”项下制备虫草素和3′-Deo各3个浓度QC样本,分别考察虫草素室温和4 ℃下放置15、30、60、120、180和480 min,-20 ℃和-80 ℃下放置8、12、24和48 h后稳定性,-80 ℃冻融1次及以上稳定性以及进样器4 ℃8 h稳定性。考察3′-Deo室温和4 ℃ 8 h稳定性,-20和-80 ℃下48 h稳定性,-80 ℃冻融3次稳定性和进样器4 ℃8 h稳定性。

2 结果

2.1专属性实验结果 虫草素、3′-Deo与内标2-Chl保留时间分别为3.15、2.85和3.29 min,血浆内源性物质在待测物保留时间内无干扰,结果见图2。

A.空白血浆;B.空白血浆加标准品;C.大鼠给药后血浆样品。

2.2标准曲线与定量下限 虫草素标准曲线为:Y=3.425 9X+0.253 4(r=0.998 3),在0.5～100 ng·mL-1范围内线性关系良好,定量下限0.5 ng·mL-1(S/N>10)。3′-Deo标准曲线为:Y=0.195 8X+0.288 6(r=0.998 6),在1～200 ng·mL-1范围内线性关系良好,定量下限1 ng·mL-1(S/N>10)。可满足血浆样本中虫草素与3′-Deo含量测定。

2.3精密度与准确度实验结果 虫草素与3′-Deo低、中、高浓度质控样本精密度和准确度良好,日内与日间RSD均<10%,准确度水平均>95%,均符合生物样本分析要求,结果见表1。

表1 虫草素与3′-Deo准确度与精密度实验结果

2.4提取回收率与基质效应 虫草素及3′-Deo低、中、高浓度质控样本提取回收率良好,虫草素及3′-Deo提取回收率别为89.6%～106.7%和87.9%～94.4%,两种物质RSD均不超过7.3%。虫草素及3′-Deo基质效应分别为90.2%～117.3%和95.2%～100.0%,RSD<9.1%,结果见表2。

表2 虫草素与3′-Deo提取回收率及基质效应

2.5稳定性 本研究主要考察室温稳定性、冻融稳定性、4 ℃稳定性、-20 ℃稳定性、-80 ℃稳定性及进样器稳定性。

血浆样本中的虫草素在室温和4 ℃放置时稳定性较差,随着时间延长,降解增加(图3),其中室温放置15 min和4 ℃放置30 min内降解率<15%。虫草素在-20 ℃和-80 ℃ 保存48 h内较稳定(图3)。室温下不同浓度虫草素在血浆样本中的降解和代谢物3′-Deo生成情况见图4。随着时间延长,血浆虫草素含量逐渐减少,而代谢物3′-Deo含量逐渐增加,8 h后血浆几乎检测不到虫草素,代谢物3′-Deo生成量占原药71.2%～89.6%。

A.室温;B.4℃;C.-20 ℃;D.-80 ℃。

A.虫草素1.5 ng·mL-1;B.虫草素7.5 ng·mL-1;C.虫草素75 ng·mL-1。

虫草素在室温15 min、4 ℃ 30 min、-20 ℃ 48 h、-80 ℃ 48 h、自动进样器4 ℃ 8 h、冻融一次条件下稳定(表3)。虫草素在冻融2次及以上稳定性差。3′-Deo稳定性较好,在室温8 h、4 ℃ 8 h、-20 ℃48 h、-80 ℃48 h、自动进样器4 ℃ 8 h、冻融3次条件下稳定(表4)。

表3 虫草素稳定性实验结果

表4 3′-Deo稳定性实验结果

2.6药动学研究结果 大鼠灌胃虫草素 10 mg·kg-1后血浆虫草素与3′-Deo药动学参数见表5。虫草素与3′-Deo血药浓度-时间曲线见图5。

表5 大鼠灌胃虫草素后虫草素与3’ -Deo的药动学参数

图5 大鼠灌胃虫草素10 mg·kg-1后虫草素 (A)与3′-Deo (B)血药浓度-时间曲线

3 讨论

笔者在本研究建立了一种具有较高灵敏度和准确度、可同时检测血浆样本中虫草素及代谢物3′-Deo的LC-MS/MS方法。虫草素极性较大,在HILIC柱中保留较差,在C18柱中保留较好。笔者考察了不同流速(0.35、0.4和0.5 mL·min-1)的影响,发现随着流速增大,3′-Deo峰型变差,出现裂峰,0.35 mL·min-1流速较合适。此外,有机相比例增加会导致3′-Deo峰展宽并伴随基线升高,但对虫草素无影响。

虫草素在血浆样本中稳定性较差,室温放置超过15 min或4 ℃放置超过30 min可降解超过15%。在空白血浆样本中加入虫草素,室温下放置8 h后血浆中虫草素几乎全部降解。为进一步研究虫草素降解过程,笔者对虫草素血浆样本室温放置不同时间后的浓度进行了动态分析,发现随着血浆中虫草素含量降低,代谢物3′-Deo含量逐渐增加,3′-Deo生成量占原药71.2%～89.6%,提示血浆中的酶无论是在体内还是体外均可代谢虫草素,且3′-Deo是生成含量最多的代谢物。为保证药动学研究准确性,对虫草素药动学操作流程进行优化,缩短样本在室温放置时间,加快样本处理过程,即取血后立即在低温下处理样本,并将整个过程控制在30 min内,减少虫草素在血浆样本中的降解。

临床应用虫草素一般采取口服给药,动物研究常采用灌胃给药途径,剂量2～50 mg·kg-1[7-9]。有关虫草素药动学研究的报道笔者较少见到。吴灵玉等[5]通过HPLC法检测大鼠灌胃40 mg·kg-1虫草素后血药浓度,由于HPLC检测灵敏度限制,给药后10～120 min均未检测到虫草素原型药物。LEE等[10]研究了大鼠灌胃虫草素8 mg·kg-1药动学,同样未检测到虫草素原型。本研究中,由于采用了高灵敏度LC-MS/MS方法,在多个时间点检测到血浆中虫草素浓度,但虫草素在大鼠体内暴露量非常低,血药浓度仅约10 ng·mL-1。在吴灵玉等[5]的研究中,曾检测到一个分子量为252的未知代谢物(推测为3′-Deo),该物质在30 min时含量最高,随后降低,而在本研究中3′-Deotmax为(29.2±8.4)min,与之一致。LEE等[10]也在血浆中检测到了代谢物3′-Deo,其Cmax为(202±98)ng·mL-1,t1/2为(1.11±0.39)h,AUC为(17 820±2 160) ng·min·mL-1,与本研究中3′-Deo的药动学参数,Cmax为(142±50)ng·mL-1,t1/2为(100.4±27.5) min,AUC为(18 034±4 981)ng·min·mL-1,较为接近。也有学者研究了大鼠静脉注射给药虫草素(10 mg·kg-1)药动学,其结果显示全血中虫草素峰浓度较高[(3.1±0.9) μg·mL-1],但半衰期短[(1.6±0.0) min][6]。

虫草素在体内可被代谢生成多种代谢物,但有关其代谢物的鉴定尚未明确[11]。血浆中检测到含量最多的代谢物是3′-Deo,但对其的活性及药理作用目前尚无统一认识。目前普遍认为,3′-Deo是虫草素的一种无活性代谢物[10,12]。也有研究认为,3′-Deo具有一定抗寄生虫、抗肿瘤作用[13-15]。近期有学者提出,虫草素在体内存在补偿代谢途径,即3′-Deo可转化为有活性的5'-三磷酸虫草素,从而发挥药理作用[10]。对虫草素口服吸收和生物转化过程以及暴露-效应关系的研究,对于阐明虫草素发挥各种药理作用的物质基础具有重要意义。虫草素及其代谢物的体内代谢过程及其与药理活性的关系,仍有待进一步深入研究。