基于HPLC 指纹图谱及多成分定量对刺五加的质量评价

宋 娟，张晶玉，吕重宁，路金才

沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016

刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus(Rupr. et Maxim.) Harms 的干燥根和根茎或茎，具益气健脾、补肾安神之效[1]。是重要的药食同源药材，有着“宁得一把五加，不用金玉满车”之盛誉，自20 世纪70 年代起，我国对刺五加的需求日渐增长，大量无节制地采挖地下部分使其资源量急剧减少。由于野生资源的剧减，刺五加混淆品开始出现， 其主要混淆品为无梗五加Eleutherococcussessiliflorus(Rupr. & Maxim.) S. Y.Hu，同时人们已开始大力发展刺五加的人工栽培，以缓解供需矛盾。

在古代本草中未有刺五加相关记载，大多仅载五加皮，“刺五加”一词始见于《中药大辞典》，其明确指出刺五加为五加皮的来源植物之一[2]。现代研究表明，刺五加中主要含有苷类、黄酮类、多糖类、香豆素、木脂素及多种微量元素和氨基酸等成分，具有改善心脑血管系统、中枢神经系统、降血糖、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳等药理作用，其中酚苷类化合物是刺五加根及根茎的主要活性成分[3-13]。

目前《中国药典》2020 年版将紫丁香苷作为刺五加化学成分含量测定的唯一内容，但中药的药理药效是源自其复杂的化学成分，而非某一单一成分，故仅以紫丁香苷作为其质量评价指标，难以准确地控制其质量[14-16]。本研究对32 批市售刺五加饮片进行HPLC 指纹图谱研究，并同时测定原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E 及丁香树脂酚7 种主要成分的含量，旨在通过多指标、多成分含量测定，以更精确、更科学的方法综合评价刺五加的质量；此外，结合多元综合分析对其进行综合评价，旨在找出对其质量影响较大的关键性成分，为其质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20 高效液相色谱仪（SPD-M20A 光电二级管阵列紫外可见光检测器、LabSolutions 色谱工作站，岛津中国有限公司），万分之一BS124S 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），十万分之一MS105DU 型电子天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司），洁盟牌JP-040 超声波清洗机（深圳市洁盟清洗设备有限公司）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，山东禹王和天下新材料有限公司），磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），甲醇（分析纯，山东禹王和天下新材料有限公司），水为娃哈哈纯净水。原儿茶酸（批号110809-201906，中国食品药品检定研究院）；紫丁香苷（批号111574-201605，中国食品药品检定研究院）；绿原酸（批号PU0100-0025，成都普斯生物科技股份有限公司）；刺五加苷E（批号PU1120-0025，成都普斯生物科技股份有限公司）；松柏苷、刺五加苷B1、丁香树脂酚、丁香树脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷4 种成分均为实验室自制，质量分数大于95.0%。

32 批市售刺五加饮片信息见表1，经沈阳药科大学中药学院路金才教授鉴定其基原植物为刺五加A.senticosus(Rupr. et Maxim.) Harms。

表1 市售刺五加饮片信息Table 1 Information on commercially available A. senticosus decoction pieces

2 方法与结果

2.1 刺五加HPLC 指纹图谱研究

2.1.1 色谱条件 色谱柱（Diamonsil 5 μm C18（2），250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（B）-0.1%磷酸水（A）；梯度洗脱（0～1 min，7%～8% B；1～10 min，8%～10% B；10～23 min，10%～15% B；23～53 min，15%～30% B；53～63 min，30%～45%B；63～73 min，45% B）检测波长210 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃；体积流量0.8 mL/min。

2.1.2 对照品溶液的制备 取原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、丁香树脂酚对照品适量，加50%甲醇溶解，分别配制成含原儿茶酸2 μg/mL、松柏苷8 μg/mL、紫丁香苷40 μg/mL、绿原酸100 μg/mL、刺五加苷B1 20 μg/mL、刺五加苷E 30 μg/mL、丁香树脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3 μg/mL、丁香树脂酚2 μg/mL 的溶液，过0.22 μm 有机滤膜，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 取刺五加粗粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用提取溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22 μm 有机滤膜，即得。

2.1.4 精密度试验 取同一批刺五加粉末（编号AS30）1 份，按照“2.1.3”项下的方法进行供试品溶液的制备，按照“2.1.1”项下的色谱条件连续进样6 次，计算其色谱峰相对保留时间和相对峰面积，结果表明：相对保留时间的RSD 小于0.08%，相对峰面积的RSD 小于2.98%。

2.1.5 重复性试验 取同一批刺五加药材粉末（编号AS30），按照“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果表明：各共有色谱峰相对保留时间的RSD 均小于0.12%，相对峰面积的RSD 均小于3.19%，结果表明该方法的重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一批刺五加药材粉末（编号AS30）一份，按照“2.1.3”项下的方法进行供试品溶液的制备，按照“2.1.1”项下的色谱条件分别于0、3、6、9、12 h 进样分析，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积，结果表明，相对保留时间RSD 小于0.09%，相对峰面积的RSD 小于2.85%，结果表明该供试品溶液在12 h 内的稳定性良好。

2.1.7 刺五加HPLC 指纹图谱的建立

（1）共有峰及内参照峰的确定：所建立的刺五加HPLC 指纹图谱，共确定18 个共有峰（内参照峰为紫丁香苷），HPLC 色谱图如图1 所示。并指认了8 个色谱峰，分别为原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和丁香树脂酚，对照品色谱图如图2 所示。

图1 刺五加HPLC 色谱图Fig. 1 HPLC fingerprint of A. senticosus

图2 混合对照品色谱图Fig. 2 Chromatogram of mixed control substance

（2）HPLC 指纹图谱的建立：取32 批市售刺五加饮片，按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液的制备，按照“2.1.1”项下的色谱条件进样分析，将所得色谱数据文件导入《中国色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》进行处理分析。以AS30 作为参照图谱，经多点校正进行自动匹配，生成指纹图谱，结果见图3；对其匹配结果进行相似度评价，结果表明：32 批市售刺五加样品的相似度范围为0.945～0.999，均大于0.945，说明各批次市售刺五加样品间主要化学成分较为一致，符合中药指纹图谱的研究要求，可用于刺五加的质量评价，为其质量控制提供依据，相似度结果见表2。

图3 市售刺五加指纹图谱Fig. 3 Fingerprint of commercially available A. senticosus

表2 市售刺五加相似度值Table 2 Similarity value of commercially available A.senticosus

2.1.8 指纹图谱结果分析 本研究对32 批市售刺五加饮片进行了指纹图谱分析，32 批样品指纹图谱相似度结果均在0.945 以上，说明各批次刺五加间主要化学成分较为一致，符合中药指纹图谱的研究要求，可用于刺五加的质量评价，为其质量控制提供依据。此外与对照品对比，指认了8 种成分，分别为原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和丁香树脂酚。

2.2 刺五加HPLC 多成分含量测定

2.2.1 色谱条件及溶液的制备 同“2.1.1”“2.1.2”和“2.1.3”项下。

2.2.2 线性关系考察 取原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚对照品适量，加50%甲醇分别配制成含原儿茶酸111 μg/mL、松柏苷104 μg/mL、紫丁香苷197 μg/mL、绿原酸498 μg/mL、刺五加苷B1 106 μg/mL、刺五加苷E 150 μg/mL、丁香树脂酚115 μg/mL 的溶液，作为对照品母液，备用。分别精密吸取各对照品适量，分别配制成6 个不同质量浓度的对照品溶液，按照“2.1.1”项下的色谱条件进样分析，以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程，如表3 所示。

表3 线性回归方程Table 3 Linear regression equation

2.2.3 精密度试验 取同一批刺五加粉末（编号AS30）1 份，按照“2.1.3”项下的方法进行供试品溶液的制备，按照“2.1.1”项下的色谱条件连续进样6 次，计算各待测色谱峰面积RSD 值，结果表明，原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚峰面积的RSD 分别小于2.89%、0.68%、0.27%、0.27%、2.79%、0.32%、0.28%，说明仪器的精密度良好。

2.2.4 重复性试验 取同一批刺五加药材粉末（AS30），按照“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按照“2.1.1”项下色谱条件进样分析，计算各待测成分的质量分数RSD 值，结果表明，原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷 E、丁香树脂酚质量分数的RSD 分别小于2.26%、3.11%、3.38%、2.97%、3.70%、2.92%、2.80%，表明该方法的重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一批刺五加药材粉末（AS30）一份，按照“2.1.3”项下的方法进行供试品溶液的制备，按照“2.1.1”项下的色谱条件分别于0、3、6、9、12 h 进样分析，计算各待测色谱峰面积RSD 值，结果表明，原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚的峰面积RSD 分别小于2.59%、0.60%、0.27%、0.25%、2.77%、0.32%、0.29%。

2.2.6 加样回收率试验 精密称取已测定的同一批次（AS30）刺五加样品0.5 g，分别精密加入适量对照品，按照“2.1.3”项下的方法平行制备供试品溶液6 份，按照“2.1.1”项下的色谱条件进样分析，计算得到原儿茶酸、松柏苷、紫丁香苷、绿原酸、刺五加苷B1、刺五加苷E、丁香树脂酚平均加样回收率分别为92.51%、97.63%、95.11%、101.08%、105.29%、98.92%、94.89%，RSD 分别为2.69%、3.44%、2.42%、2.24%、1.32%、2.71%、2.99%，表明该方法的准确度良好。

2.2.7 样品测定 取32 批市售刺五加饮片，按照“2.1.3”项下方法进行供试品溶液的制备，按照“2.1.1”项下的色谱条件进样分析并计算样品中7 种成分的含量，结果见表4。

2.2.8 含量测定结果分析 以指纹图谱方法为基础，对其中7 种成分进行了含量测定，结果表明32批样品中各成分含量分别为原儿茶酸为0.003%～0.016%；松柏苷为0.032%～0.005%；紫丁香苷为0.027%～0.120%；绿原酸为0.236%～0.624%；刺五加苷 B1 为 0.022%～0.146%；刺五加苷 E 为0.055%～0.096%；丁香树脂酚为0.002%～0.010%；由上可知不同批次市售刺五加饮片中各成分含量波动较大。

（1） 主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，PLSADA）：在进行PCA 之前，使用IBM SPSS Statistics 26 软件对32 批市售刺五加饮片中7 种成分的色谱峰面积进行KMO 和巴特利特检验，得到KMO 度量值为0.574，P为1.150 6×10-13，虽然KMO 值相对较小，但是其值大于0.5，此外P值小于0.05，提示可以进行PCA 分析，故利用上述软件进行数据分析，得到特征值及方差贡献比例，见表5。以特征值及方差累计贡献率作为确定主成分个数的选择依据，共有2 个主成分的特征值大于1，其方差累计贡献率为66.920%，从碎石图（图4）可知，所提取的主成分中，前2 个主成分的斜率较大，而后各主成分的斜率相对较小，说明前2 个主成分在一定程度上可以用来表示刺五加的质量。对所选择的2 个主成分进行分析及得分计算，结果见表5。通过SIMCA 14.1 软件对32 批样品中7 种成分的色谱峰面积进行主成分分析并绘图，所得PCA 的Biplot 图（图5）；此外对数据进行OPLS-DA，可得VIP 值，结果见图6。

图4 主成分碎石图Fig. 4 Scree plot of principal components

图6 OPLS-DA VIP 值Fig. 6 VIP value of OPLS-DA

表5 主成分得分、综合得分及排序Table 5 Principal component score, composite score and ranking

由表5 和图4 可知，2 个主成分所反映的信息和主成分分析所得结果相符，可以得到以下相关信息：（1）可以将32 批样品分成2 类，第1 类：AS1、AS5、AS10、AS11、AS13、AS14、AS15、AS16、AS18、AS20、AS22、AS24、AS26、AS27、AS29、AS30；第2 类：AS2、AS3、AS4、AS6、AS7、AS8、AS9、AS12、AS17、AS19、AS21、AS23、AS25、AS28、AS31、AS32。（2）图5 中每个圆点代表1 个成分，其离原点越远表示组间差异性越大，从图中可知紫丁香苷、刺五加苷B1、松柏苷及绿原酸明显偏离原点。（3）通过图6 中VIP 值大于1，可以筛选出2 个差异成分（紫丁香苷、刺五加苷B1），该结果和主成分分析结果较为一致，表明这2 个成分可能是对刺五加质量差异影响较大的成分。

（2）Pearson 相关性分析：Pearson 相关性分析是用来衡量2 个变量之间是否存在线性关系的分析方法，其衡量标准用相关系数（r）来表示，其数值为±1，可表示2 个变量间的线性关系强度及方向。使用IBM SPSS Statistics 26 软件对32 批刺五加中7种成分含量进行Pearson 相关性分析，结果见表6。由r可知紫丁香苷、绿原酸与刺五加苷B1 与其他成分的相关性最强，其中紫丁香苷与原儿茶酸、松柏苷、刺五加苷B1 呈显著正相关，与绿原酸呈显著负相关；绿原酸与原儿茶酸、紫丁香苷、刺五加苷B1 和丁香树脂酚呈显著负相关；刺五加苷B1 与原儿茶酸、松柏苷和紫丁香苷呈显著正相关，与绿原酸呈显著负相关。

表6 Peaeson 相关性分析结果Table 6 Peaeson correlation analysis results

3 讨论

该实验研究前期进行色谱条件优化时，对刺五加供试品溶液在190～400 nm 紫外-可见光全波长扫描，结果表明210 nm 下的色谱峰数目、峰形、分离度较好，较为适宜指纹图谱的研究，故该研究选择210 m 作为检测波长；此外该研究为了寻求较优的色谱条件，先后考察了不同提取溶剂（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、无水乙醇）、提取方式（加热回流提取，超声提取）、提取时间（15、30、45 min）、料液比（1∶10、1∶25、1∶40）、不同流动相体系（甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸水，乙腈-0.1%磷酸水）、柱温（25、30、35 ℃）、体积流量（0.8、1.0、1.2 mL/min），结果表明选择柱温30 ℃，体积流量0.8 mL/min，流动相体系为乙腈-0.1%磷酸水，50%甲醇超声提取30 min时，所得色谱结果的色谱峰数目、峰形以及分离度较好。

通过HPLC 法建立了刺五加指纹图谱，并基于该方法同时测定了7 种成分的含量。基于刺五加含量测定结果，以7 种主要成分进行了PCA 分析、OPLS-DA 分析和Pearson 相关性分析，结果表明紫丁香苷、绿原酸和刺五加苷B1 可能为刺五加质量差异的关键性成分，其中Pearson 相关性分析表明绿原酸与各成分多呈负相关，紫丁香苷和刺五加苷B1 除了与绿原酸呈负相关外，与其他成分均呈正相关，说明这3 种成分对其他组分存在较为紧密的联系，综合各分析方法结果，说明紫丁香苷、绿原酸和刺五加苷B1 在一定程度上可代表刺五加的质量。

我国现有的中药质量评价模式多采取传统鉴别（性状鉴别、显微鉴别）和化学成分分析相结合的方式[14-15]。但中药的化学成分十分复杂，不同于成分单一、疗效及机制相对明确的化药，故该评价方式并不能十分准确的评价中药材或中药复方的质量。因此，对指标成分的选取原则以及选择的指标成分能否有效地反映中药的质量，能否代表整个中药或复方，成为当前中药分析研究的重点与难点。本研究结果表明刺五加中紫丁香苷、绿原酸和刺五加苷B1 对刺五加质量联系紧密，故在其质量控制中可综合考虑这3 种成分；此外，本实验通过色谱优化以及方法学考察建立了刺五加指纹图谱和含量测定的方法，该方法简单、准确、重复性好；可用于刺五加的质量评价，为其质量控制提供依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突