女贞子活性成分抗肝纤维化作用机制研究进展

叶子雨，何学东，郑永军，李婉婧，曾晴勤，李 瑞，刘梦琪，张 璟，郑亚东，杨永春，赵金国，宋厚辉*

1. 浙江农林大学动物科技学院，动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心，浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地，中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江 杭州 311300

2. 福建农林大学动物科学学院（蜂学学院）/福建-台湾动物病原生物学重点实验室，福建 福州 350002

3. 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心），国家卫生健康委员会寄生虫病原与媒介生物学重点实验室，世界卫生组织热带病合作中心，国家级热带病国际联合研究中心，上海 200025

4. 甘肃省天水市动物疫病预防控制中心，甘肃 天水 741000

肝纤维化为一种以细胞外基质（extracellular matrix，ECM）异常沉积为特征的病理过程，是造成全球疾病负担增加的重要因素[1]。因病毒/寄生虫感染、炎症、机械损伤、自身免疫性疾病等因素，肝脏中的非实质细胞即肝脏星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）激活，转化成肌成纤维细胞，分泌大量的ECM 并在肝脏间质中沉积，形成瘢痕[2]。一般情况下，机体会自动启动抗纤维化反应，使肌成纤维细胞逆转为HSC 或发生凋亡，促进瘢痕消退，但在慢性肝病中，肌成纤维细胞会持续激活，使促纤维化和抗纤维化失衡，从而导致ECM 的过度合成，最终引起肝纤维化[3]。肝纤维化作为从慢性肝病最终发展为肝衰竭/肝癌的中间环节，如何逆转肝纤维化是目前具有十分重要研究意义的热点课题。女贞子是木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实，又名“冬青子”，具有十分高的药用价值[4]，《神农本草经》曾记载“女贞实，味苦平，主补中，安五脏，养精神，除百病”[5]。女贞子含有多种活性成分，如三萜类：齐墩果酸、熊果酸、乙酰齐墩果酸等；环烯醚萜类：女贞苷、特女真苷等；黄酮类：芹菜素、槲皮素等；苯乙醇苷类：红景天苷、毛蕊花苷等，具有调节保肝、免疫、抗癌、抗肿瘤等功效[6]。此外，女贞子还含有一些多糖、脂肪酸等[7]。本文基于转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4）/活性氧、磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信号转导与转录激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等信号通路相关研究，就女贞子的抗肝纤维化作用机制进行综述，为女贞子的临床应用提供参考。

1 肝纤维化

慢性肝病发展到后期时，肝细胞受损严重，炎性细胞浸润并分泌大量的炎症因子，导致HSC 激活并增殖。正常情况下，HSC 以静息状态存在于肝脏的窦周隙中[2,8]，参与调节ECM 的产生和降解，以及肝窦血流。然而，当肝脏受损时，肝脏血窦内散在的组织驻留巨噬细胞即库普弗细胞激活，在多种细胞因子的共同作用下，促进HSC 活化。因HSC表达TGF-β1 受体，同时也可以分泌TGF-β1，在这种情况下形成正反馈调节环路，导致HSC 持续激活。激活的HSC 转化为肌成纤维细胞，使α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），I、III型胶原蛋白，纤连蛋白及层黏连蛋白等一些促纤维化相关蛋白表达增加。正常情况下，ECM 的合成与降解受基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和基质金属蛋白酶抑制因子（tissue inhibitors of MMP，TIMPs）的调控，处于动态平衡，但在肝纤维化发生时，该平衡遭到破坏，ECM 合成增加、降解减少，导致ECM 出现过度合成，进而引起肝纤维化的发生[9]。

2 女贞子活性成分抗肝纤维化作用机制

2.1 TGF-β/Smad 信号通路的调节机制

TGF-β 家族成员主要包括TGF-β、骨形态发生蛋白及激活素等，其中TGF-β 激活并介导TGF-β/Smad 信号通路，促使HSC 转化为肌成纤维细胞，在肝纤维化发生过程中具有重要作用[10]。TGF-β/Smad 信号通路的组成主要包括3 部分：位于胞外的TGF-β 配体、细胞膜表面TGF-β 受体及胞内传递信号的Smad 蛋白[11]。Smad 蛋白在TGF-β/Smad信号通路的下游发挥作用，直接参与并影响肝纤维化发生[12]。

TGF-β/Smad 有2 种存在形式：基础状态和激活状态[10,13]。当处于基础状态时，TGF-β 配体被ECM 或其他物质隔离，以复合物形式稳定存在，使其无法与受体结合而发挥作用，但当其被激活时，TGF-β 配体从相应的复合物中解离出来，与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶即I 型受体（TGF-β type I receptor，TβR-I）和TβR-II 直接结合，或在其他辅助分子的作用下再与上述2 种受体结合。之后，TβRII 作用于TβR-I 近膜调控区，使之发生磷酸化，进而引起受体调控型Smad（receptor-regulated Smad，R-Smad）进行磷酸化反应，最后磷酸化的R-Smad 与Smad3 形成复合体入核并调控相应基因的表达[10]。

黄酮类成分对肝脏具有独特的保护作用，可缓解肝纤维化的发生[14-15]，其中芹菜素是女贞子中主要的黄酮类成分，其还存在于柑橘类水果、欧芹和芹菜叶等植物中[16]。在CCl4和胆管结扎的肝纤维化动物疾病模型中，芹菜素可下调TGF-β1、Smad3、p-Smad3 的表达，说明芹菜素可抑制TGF-β1/Smad3通路；通过测定血清中的丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平，及苏木精-伊红和Masson 染色，发现芹菜素可显著改善肝细胞的排列紊乱，纤维组织增生和炎性细胞浸润明显减少，可见芹菜素对肝纤维化有一定的治疗作用，可能与抑制TGF-β1/Smad3 通路有关[17]。此外，女贞子中的木犀草素、槲皮素和花旗松素等其他一些黄酮类成分也可通过该通路发挥抗肝纤维化作用。其中，木犀草素广泛存在于菊花、胡椒、洋葱等多种植物中，是天然的四羟基黄酮类成分，其药理作用广泛，包括抗肿瘤、抗氧化等[18]。通过探究木犀草素影响HSC 增殖、激活等的相关机制，发现其可以显著抑制Smad2 和Smad3 的磷酸化，表明木犀草素可以抑制TGF-β1/Smad3 通路，具有抗肝纤维化的潜力[19]。槲皮素也是一种广泛存在于多种植物的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎等多种功能[20]。同样，槲皮素也可显著降低血清中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3 的水平；免疫组织化学染色显示，经槲皮素处理后肝脏组织中TGF-β1、p-Smad2 和p-Smad3 的表达水平显著下降，提示槲皮素对TGFβ1/Smad3 通路具有抑制作用[21]。此外，通过检测肝纤维化小鼠模型肝脏中的AST 和ALT，发现槲皮素可降低AST、ALT 水平，减轻肝纤维化的发展程度。以上结果提示，槲皮素可通过TGF-β1/Smad3 通路抑制肝纤维化[21]。花旗松素存在于长白落叶松、黄芪、洋葱等诸多植物中，具有4 个酚羟基和1 个羟基，由于这种特殊的化学结构，使其成为最强效的天然抗氧化剂，具有抗氧化应激、保肝等多种药理作用[22]。通过探究花旗松素保肝作用及其分子机制，发现相较于CCl4诱导的肝纤维化模型组，花旗松素20、40、80 mg/kg 处理组中TGF-β1、α-SMA的mRNA 及蛋白水平显著下调，且40、80 mg/kg 剂量组中Smad3 的蛋白水平也呈下调趋势[23]，表明花旗松素可以通过抑制TGF-β1/Smad3 信号通路抑制HSC 的活化，从而发挥抗肝纤维化作用。

苯乙醇苷类化合物为一类天然糖苷类化合物。到目前为止，已从女贞子中分离出了18 种苯乙醇苷类化合物，如红景天苷和松果菊苷等[7]。其中，松果菊苷由糖基、苯丙烯基和苯乙醇基构成，大量存在于松果菊属植物的根茎中，具有保肝、抗肿瘤、消炎等作用[24]。研究发现，松果菊苷可下调Smad2、Smad3 的表达及其磷酸化水平，同时上调Smad7 的表达，提示松果菊苷通过抑制TGF-β/Smad 信号通路，具有调节HSC 活化的潜在功能[25]。红景天苷作为女贞子中主要药效成分之一，其药理作用十分广泛，具有保肝、抗肿瘤、抗氧化应激等功能[26]。红景天苷可通过下调HSC 中TGF-β1 的表达抑制TGF-β/Smad 信号通路，影响HSC 的激活和自噬，导致ECM 合成下降，促进失衡的MMP2 和TIMP1恢复正常[9]。岳学良[27]通过研究红景天苷对CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型的影响，发现其可有效缓解肝纤维化，且与模型组相比，红景天苷20、40 mg/kg组的肝组织中TGF-β 及Smad3 的表达量均显著下调，提示红景天苷可能通过TGF-β/Smad3 信号通路抑制肝纤维化发生。

女贞子中还含有一些环烯醚萜类和三萜类化合物，可能通过TGF-β/Smad 信号通路发挥潜在的抗肝纤维化作用。女贞苷是女贞子中具有多种药理作用的环烯醚萜类物质活性成分[28]。体内实验表明，女贞苷可以降低肝纤维化小鼠的肝脏指数，下调肝脏ALT、AST 的表达，说明女贞苷可以有效改善CCl4诱导的肝纤维化中的肝损伤程度。同时，女贞苷也可降低肝脏HSC 中I 型胶原蛋白、α-SMA，及TβR-I、TβR-II、p-Smad2、p-Smad3 和Smad4 的表达。这些研究结果提示，女贞苷可能通过TGF-β/Smad 信号通路缓解肝纤维化[29]。委陵菜酸是一种五环三萜化合物，广泛存在于蔷薇科、紫草科植物中，具有保肝、消炎镇痛、抗氧化等多种药理活性[30]。研究表明，委陵菜酸不仅可显著抑制HSC 的活化，而且还能显著下调Smad4 的表达，提示委陵菜酸可能通过TGF-β/Smad 信号通路调节HSC 的活化[31]。

2.2 NOX4/活性氧信号通路的调节机制

NOX4 是NOX 中的一员。NOX 是由6 种蛋白质亚基（gp91phox、p22phox、p47phox、p40phox、p67phox和小GTP 连接酶Rac）组成的复合体[32-33]，主要存在于吞噬细胞的胞质及细胞膜上，其产生的活性氧可引起强烈的炎症反应，起到清除病原的作用；非吞噬细胞中的NOX 同样也可产生活性氧，但其作用主要是调控细胞凋亡、增殖等[34]。在肝损伤过程中，NOX4 通过诱导p22phox亚基的表达促进活性氧的合成，进而激活酪氨酸蛋白激酶，引发氧化应激反应[35]；肝细胞中高浓度的活性氧能抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，诱发细胞凋亡[36]。此外，NOX4 还参与HSC 的增殖和凋亡，并在肌成纤维细胞的迁移过程中发挥重要功能[37]。

熊果酸是女贞子中的一种三萜类化合物，具有保肝、调节血脂、抗骨骼肌萎缩等多种药理作用[38]。研究发现，熊果酸可抑制HSC 中NOX4 的表达，缓解肝组织的氧化应激反应。并且，熊果酸还可抑制HSC 的活化及肝细胞的凋亡[39]。可能是通过抑制促肝纤维化因子血管紧张素II（angiogenin II，AngII）引起的NOX 活化，进而抑制HSC 的增殖及I 型胶原蛋白合成实现的[40-41]。这些研究结果表明，熊果酸可通过NOX4/活性氧信号通路逆转肝纤维化发生。

羟基酪醇为苯乙醇苷类化合物，也是女贞子中的有效成分之一，其为木犀科植物中以酯类形式存在的天然多酚化合物，具有抗氧化活性[42]。酪醇和羟基酪醇均能显著下调NOX4 的表达，抑制HSC 的活化，从而发挥抗肝纤维化作用[43]。

2.3 PI3K/Akt 信号通路的调节机制

PI3K 是位于PI3K/Akt 信号通路上游的重要分子，其激活后可将磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate，PIP2）磷酸化为 PIP3[44]。 在磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK）的作用下，PIP3 将Akt 募集到质膜上并使之发生磷酸化，从而激活Akt[45]，正向调控细胞周期，促进HSC的活化增殖及胶原蛋白的合成，进而导致肝纤维化发生[46]。

女贞子中的熊果酸和委陵菜酸可通过PI3K/Akt 信号通路发挥抗肝纤维化功能。研究发现，大鼠肝星状HSC-T6 细胞经AngII 刺激后，PI3K/Akt信号通路相关蛋白（PI3K、p-Akt、p-p38 和MAPK）的表达明显升高，说明AngII 可以激活PI3K/Akt 信号通路。与AngII 组相比，熊果酸＋AngII 组中PI3K/Akt 信号通路相关蛋白的表达及I 型胶原蛋白mRNA 的水平显著下降，同时HSC 的活化增殖程度也显著降低，提示熊果酸可通过PI3K/Akt 信号通路抑制HSC 活化增殖，使I 型胶原蛋白合成减少，从而缓解肝纤维化[40]。与熊果酸相似，委陵菜酸也可显著下调HSC 中PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 和磷酸化黏着斑激酶的表达水平，提示委陵菜酸可通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路调节肝纤维化[47]。

女贞子中的黄酮类化合物芹菜素、槲皮素和花旗松素同样也可通过PI3K/Akt 信号通路发挥抗肝纤维化功能[21,23,48]。其中，芹菜素能够缓解肝纤维化小鼠的肝脏损伤程度，减轻其病理变化，同时对上皮细胞间质转化也具有明显的抑制作用。进一步研究发现，芹菜素可显著抑制p-PDK1 和p-Akt 表达水平，提示芹菜素的抗纤维化作用可能是通过抑制PDK1/Akt 信号通路而实现的[48]。同样，槲皮素也能有效降低血清中p-PI3K、p-Akt 及肝脏组织中p-Akt 的表达；在小鼠肝纤维化模型中，槲皮素可抑制HSC 活化、促进ECM 降解，提示槲皮素对肝纤维化的抑制作用可能与PI3K/Akt 通路密切相关[21]。

2.4 p38 MAPK 信号通路的调节机制

MAPK 是一种分布于胞浆中的蛋白激酶，作为MAPK 家族中的重要一员[49]，具有对丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化的能力，可通过结合膜受体及调控胞内因子参与信号转导，最终以保守的三级激酶级联形式激活并参与肝纤维化等多种疾病的发生[50]。研究证明，p38 MAPK 的表达可以促进HSC 的活化，加快肝纤维化发展进程。并且，HSC 活化程度越高，p-p38 MAPK 水平也越高；在阻断p38 MAPK 信号通路后，HSC 活化程度显著降低[19,51]。

女贞子中白桦脂醇属于三萜类化合物，具有抗艾滋病、抗肿瘤等活性。白桦脂醇是p38 MAPK 信号通路的抑制剂，可显著降低乙醇诱导的 p38 MAPK 磷酸化水平[52]，但其是否具有抗肝纤维化的功能仍需实验进一步确定。女贞子中的另1 种三萜类化合物也具有类似的作用：在HSC-T6 细胞中，熊果酸可以抑制瘦素诱导的p-p38 MAPK 水平，其抑制效果与p38 MAPK 抑制剂SB203580 相似[53]，提示熊果酸可负调节p38 MAPK 信号通路，进而发挥抗肝纤维化的作用。

橄榄苦苷是女贞子中一种具有天然裂环烯醚萜苷骨架的多酚化合物，具有抗癌、抗氧化、抗炎等活性[54]。利用肝纤维化小鼠模型发现，橄榄苦苷具有减轻肝脏病理损伤的作用，并且与对照组相比，橄榄苦苷组的肝组织中p38 磷酸化水平和转录因子ETS 结构域蛋白（transcription factor ETS domaincontaining protein，ELK-3）蛋白表达显著下调[55]，表明橄榄苦苷可能通过p38 MAPK/ELK-3 信号通路参与调节肝纤维化发生。

槲皮素作为女贞子中的一种黄酮类化合物，其抗肝纤维化作用较为复杂[21,56]。除TGF-β/Smad 和PI3K/Akt 信号通路外，槲皮素还可通过p38 MAPK信号通路调控肝纤维化[57]。

2.5 JAK/STAT 信号通路的调节机制

JAK 是主要分布在细胞膜表面的一类蛋白激酶，参与细胞因子受体介导的信号转导，处于JAK/STAT 信号通路中的上游，其家族成员有JAK1、JAK2、JAK3、TYK2 等[58]。STAT 是一类具有信号转导与转录激活功能的胞浆蛋白，作为JAK 的底物，发挥信号转导功能，可将信号从上游传递入核，调控相应基因的表达。目前，STAT 家族成员共有7个：STAT1～4、STAT5a、STAT5b 和STAT6[59]。在肝纤维化发生过程中，JAK/STAT 信号通路发挥着重要作用[60]。肝纤维化相关分子，如瘦素、α 干扰素、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等，在与HSC细胞膜上的特异性受体结合后，会激活胞内JAK/STAT 信号通路，逐步将信号转导入核，调控相关靶基因的表达[60]。

瘦素是引起肝纤维化的一类重要因子，可激活JAK2/STAT3 信号通路。但经熊果酸处理后，瘦素激活的HSC 中的p-JAK2 和p-STAT3 表达水平会显著下降，且与JAK 抑制剂AG490 相比，二者的抑制效果相近[61]，提示熊果酸能抑制瘦素诱导的JAK2/STAT3 信号通路的激活，具有潜在的抗肝纤维化功能。与熊果酸相似，木犀草素也可呈剂量相关性显著降低p-STAT3 水平，提示其抗肝纤维化功能可通过抑制STAT 信号通路实现[62]。

2.6 NF-κB 信号通路的调节机制

NF-κB 在机体正常或患病状态下均可表达，参与多种转录调控，在肝纤维化发生过程中具有重要作用。Rel 蛋白质家族是一类与NF-κB 结构相关的蛋白，包括p50、p52、p65、RelB 和c-Rel，能够入核与相应靶基因结合，发挥调控作用[63]。在肝纤维化发生过程中，库普弗细胞通过NF-κB 信号通路合成各种炎性因子，不断激活HSC，同时抑制激活的HSC 发生凋亡，促进肝纤维化进一步发展[64]。

在女贞子中，一些三萜类化合物可通过NF-κB信号通路调节肝纤维化发生，包括熊果酸、委陵菜酸、白桦脂醇和白桦脂酸等。其中，熊果酸可通过抑制NOX 的激活，下调NF-κB 的活性，从而降低HSC 细胞增殖、转化及ECM 的合成，减缓肝纤维化进程[65]。与熊果酸不同，委陵菜酸则是通过下调NF-κB 信号通路相关蛋白p-p65、p-IκB-α 和p-IKKα/β 磷酸化水平，抑制NF-κB 信号通路，促进HSC 的凋亡，抑制ECM 的产生与沉积[66-67]。同样，白桦脂醇和白桦脂酸也可下调NF-κB 及p-IκBα 的水平，抑制HSC 的活化，说明白桦脂醇和白桦脂酸也可通过抑制NF-κB 信号通路在肝纤维化发生过程中发挥作用[52]。

此外，还有某些黄酮类、苯乙醇苷类化合物同样可以通过该通路发挥抗肝纤维化功能，包括槲皮素[56]、红景天苷[68]等。

3 结语与展望

自“禁抗令”实施以来，中药因无明显的不良反应、来源广泛、易获得、药理作用广等优点受到人们的广泛关注，其替代抗生素已然成为了一种趋势。本文基于在肝纤维化发生过程中发挥重要作用的信号通路，包括TGF-β/Smad、NOX4/活性氧、PI3K/Akt、p38 MAPK、JAK/STAT 和NF-κB 等，对女贞子活性成分的抗肝纤维化作用机制进行归纳总结（图1）。熊果酸、芹菜素、槲皮素和花旗松素等各种女贞子中的活性成分，可通过以上一种或多种信号通路抑制HSC 活化增殖与肌成纤维细胞形成、调节HSC 细胞凋亡、维持MMP 和TIMP 间的平衡等，减少ECM 合成，发挥抗肝纤维化功能。

图1 女贞子活性成分抗肝纤维化的作用机制Fig. 1 Mechanisms of anti-fibrosis by active ingredients of Ligustri Lucidi Fructus

女贞子中的一些活性成分可通过多种信号通路参与调控肝纤维化发生，如花旗松素可通过PI3K/Akt/mTOR 和TGF-β/Smad 信号通路发挥抗肝纤维化作用，红景天苷可通过TGF-β/Smad 和NF-κB 信号通路发挥抗肝纤维化作用，但这些信号通路间是如何互相协调发挥作用，不同活性成分通过同种信号通路发挥作用时是否存在竞争关系，是后续需要深入研究的内容。再者，对于肝纤维化病理模型而言，常用的建模方法主要为4 类：化学药物注射法、特殊饮食饲喂法、遗传修饰法、手术法[69]。其中CCl4皮下注射法因便捷、低廉、易于重复等优势而被广泛应用，但啮齿类动物对CCl4的毒性敏感，在造模过程中极易因剂量过大而引起动物死亡，需根据动物种类、体质量等因素斟酌用药剂量、配比、给药频率及给药时间。目前中药单体或复方抗肝纤维化的作用研究大多采用CCl4皮下注射建模，病因较单一，但在临床上肝纤维化的病因却多种多样，因此在解析女贞子等中草药抗肝纤维化的作用机制时，利用CCl4肝纤维化模型是否合适也需进一步商榷。此外，女贞子中还存在一些未解析的物质，这些物质与已知物质是否存在协同或拮抗作用，仍需要深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突