独活挥发油低共熔溶剂辅助微波水蒸气蒸馏法提取及质量标志物（Q-Marker）研究

李 欠，尹转霖，丁小琴，姜 侃

甘肃农业大学农学院，省部共建干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃 兰州 730070

独活AngelicaePubescentisRadix是我国重要的传统中药材，有很高的药用价值。而独活挥发油作为独活的主要药理成分，具有抗炎、抗氧化、镇痛、理气、抗菌、抗肿瘤等作用[1-2]。现阶段对独活挥发油的高效提取与质量控制缺少系统的研究。目前，提取挥发油的传统方法有：水蒸气蒸馏法（steam distillation，SD）、溶剂提取法、索氏提取法、机械萃取法等[3]。传统的提取工艺有萃取时间长、效率低、耗能大，部分方法采用有毒溶剂等弊端。微波辅助提取技术作为一种新的提取方法，具有能量传递快、提取效率高、耗时短、耗能低、绿色环保等优势，在挥发油提取方面具有较好的应用前景[4-7]。另一方面，低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs）作为一种环境友好型溶剂，被广泛用于提取中药活性成分领域，具有提取效率高的优点[8-13]，目前其在挥发油的提取方面应用较少，具有非常广阔的前景。

中药质量评价方法可以分为化学评价、生物评价和化学-生物相结合的评价方法[14]。在已有质量评价方法的基础上，刘昌孝院士[15]于2016 年提出利用中药质量标志物（quality markers，Q-Marker）评价中药质量的方法，该方法能够更加全面客观的评价中药质量，为中药质量控制提供了新的思路。网络药理学能够揭示中药成分与相关靶点相互作用的机制，系统地、全面地展示了疾病与靶点蛋白、靶点蛋白与药物以及药物与药物之间的相互联系[16-17]，能够预测潜在生物机制下的有效成分或组分，鉴定Q-Marker。

分子对接技术可以在理论上研究药物小分子与靶点蛋白的作用，进一步预测小分子的生物活性。将网络药理学的方法与成分分析方法相结合，能够快速、准确地找到Q-Marker，并利用分子对接的方法，确认了主要活性物质的作用靶点[18-20]，为中药Q-Marker 预测提供理论基础，具有良好的应用前景。本研究采用DESs 辅助微波水蒸气蒸馏法（DESs assisted microwave steam distillation，DES-A- MSD）提取独活挥发油，并与SD 法和微波辅助水蒸气蒸馏法（microwave assisted steam distillation，MASD）2 种提取方法进行对比，确定独活挥发油的最佳提取工艺。利用气相色谱-质谱法（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析不同提取方法得到的独活挥发油的化学成分的差异，根据挥发油化学成分，结合网络药理学和分子对接预测独活挥发油Q-Marker，为其质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

XH-MC-1 型实验室微波合成反应仪，北京祥鹄科技发展有限公司；INNOTEG-Science One MR1 型磁力搅拌器，德祥科技有限公司；HX203T 型电子天平，1.0 mg，慈溪市天东衡器厂；WK-1000 型小型高速粉碎机，山东精诚医药装备制造有限公司；Agilent 7890B-7000D 型三重四极杆气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦公司；PTHW 型电热套，郑州科丰仪器设备有限公司。

1.2 材料

独活药材采自湖北省宜昌市五峰土家族自治县，由甘肃农业大学陈垣教授鉴定并确认，为伞形科当归属植物重齿毛当归AngelicapubescensMaxim. f.biserrataShan et Yuan 的干燥根。将独活药材清洗干燥后粉碎成粉末，过40 目筛，于4 ℃下储存。正己烷为色谱纯，氯化胆碱、尿素、甘油、乙二醇、乳酸、葡萄糖、柠檬酸、1,3-丁二醇为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 DES 的制备

本研究采用加热搅拌法，以氯化胆碱、尿素、甘油、乙二醇、乳酸、葡萄糖、柠檬酸、1,3-丁二醇为原材料制备DES。按照表1 将氢键供体（H-bond donor，HBDs）和氢键受体（H-bond acceptor，HBAs）以一定的物质的量比和/或水混合在圆底烧瓶中，使用磁力搅拌器将其加热搅拌，直至形成均匀、透明、稳定的液体。

表1 不同DESs 的制备Table 1 Preparation of different DESs

2.2 独活挥发油不同提取方法的比较

为了获得一种高效、绿色、低耗能的提取工艺采用SD 法和MASD 法提取独活挥发油，并与DESA-MSD 法进行比较。SD 法是将混合物加热至沸腾状态后保持5 h；MASD 法用蒸馏水作为溶剂进行微波萃取。具体实验参数如下。①SD 法条件：料液比1∶5，蒸馏时间5 h；②MASD 法条件：料液比1∶5，微波功率400 W，温度100 ℃，蒸馏时间60 min；③DES-A-MSD 法条件：料液比（独活粉末-DESs）1∶3，预处理后再加一定量蒸馏水，微波功率400 W，温度100 ℃，蒸馏时间60 min。

SD 法、MASD 法与DES-A-MSD 法的挥发油得率分别为0.28%、0.36%和0.50%。DES-A-MSD法提取率最高，大约是传统提取工艺SD 法的2 倍，且此法显著缩短了提取时间。微波技术会加热独活细胞内部的水分，使细胞壁破裂，加速了细胞内挥发性成分的溶出，DESs 相比于水具有更好的溶解性和穿透力，能够增大独活在溶剂中的溶解度，使细胞内成分不断的扩散出来，进而提高独活挥发油得率[21-22]。因此，DES-A-MSD 法的独活挥发油得率高，且提取时间短，更利于独活挥发油的提取。

2.3 最佳DESs 的筛选

DESs 由不同的天然化合物混合制备而成，其中氢键受体和氢键供体的不同组合会影响DESs 的理化性质。通过尿素、甘油、乙二醇、乳酸、葡萄糖、柠檬酸、1,3-丁二醇与氯化胆碱的混合，制备出7 种DESs。其中一些DESs 需加入一定量的水以降低其黏度。精确称取100 g 独活粉末，使用磁力搅拌器，将称好的独活粉末与制备好的DESs，按照1∶3 的料液比进行混合搅拌，后转入微波反应器中，在微波功率600 W、温度80 ℃的条件下反应10 min，对混合物进行微波辐射预处理，然后加入200 mL 蒸馏水，磁力搅拌将其混匀，后将所有样品溶液转移至三颈烧瓶内并放入微波反应器中，如图1 所示。将烧瓶与V 型提取器和回流冷凝管相连，实现独活挥发油的收集和凝结水的回流。先设置微波功率600 W、温度为103 ℃、反应时间为5 min，让混合物的温度迅速升高，使其接近沸点，最后在微波功率400 W、温度100 ℃的条件下持续蒸馏60 min。每次提取均有3 次重复。将收集的挥发油脱水处理，低温（4 ℃）保存。挥发油得率计算公式如下。结果表明，不同的DESs 均可以提取出一定量独活挥发油，但是得率有较大差异。其中，DES-4（氯化胆碱-乳酸）所提取的挥发油得率最高，得率达0.5%；DES-2（氯化胆碱-甘油）和DES-6（氯化胆碱-柠檬酸）所提取的挥发油得率次之，DES-5（氯化胆碱-葡萄糖）所提取的挥发油得率最低。这可能是由于有机酸类成分能够更好吸收微波辐射，并促进独活细胞大量释放挥发性成分，进而提高挥发油得率[23]。最终考虑到挥发油得率，选择DES-4 用于后续优化实验。

图1 微波提取挥发油装置示意图Fig. 1 Diagram of microwave extraction unit for volatile oil

Y＝V/W

Y是挥发油得率，V是挥发油的体积，W是独活粉末的质量

2.4 挥发油成分GC-MS 分析

采用SH-Rxi-5 MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），对挥发油进行GC-MS 分析。程序初始温度为50 ℃，保持3 min，后以4 ℃/min 升温，温度升至250 ℃，保持1 min。进样口温度为250 ℃，体积流量为1 mL/min，氦气为载气。离子源温度设置为200 ℃，扫描范围m/z33～500，质谱采集3.5～54 min。分别使用数据库（NIST14）比对和峰面积归一化法对检测到的化合物进行定性和定量分析。

GC-MS 分析结果（表2）表明，SD 法得到挥发油成分占总峰面积的83.52%，MASD 法占97.92%，DES-A-MSD 法占80.6%。由此可见，DES-A-MSD法的挥发油得率最高，但是纯度较低；而MASD 法提取的挥发油得率中等，纯度最高。微波提取法加热时间短，会降低挥发油热降解，所以MASD 法提取出来的挥发油纯度较高。SD 法加热时间长，提取效率低，会导致热降解，所以挥发油纯度较低。另一方面，由于DESs 的溶解能力强，可能与部分非目标成分有较好的亲和力，导致一些非挥发性成分被萃取出来，虽然提高了得油率，但是降低了挥发油纯度[24-25]。以上3 种方法得到的独活挥发油中主要活性成分有β-瑟林烯、α-蛇床烯、红没药醇、蛇床子素、2-羟基环十五酮。

表2 独活挥发油的主要成分Table 2 Main components of volatile oils from Angelica Pubescens Radix

2.5 单因素试验考察不同因素对挥发油得率的影响

根据单因素试验来探究HBA 与HBD 不同物质的量、微波功率和DESs 含水量对独活挥发油得率的影响。每个试验均有3 次重复。

2.5.1 HBA 与HBD 不同物质的量比对独活挥发油得率的影响 当合成DESs 时，氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）的物质的量比会影响DESs 的极性、黏度和表面张力[26]。保证其他实验条件不变，本实验考察了HBA 与HBD 不同物质的量比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）合成的DESs 对独活挥发油提取的影响，独活挥发油得率分别为0.42%、0.50%、0.45%、0.38%、0.30%，当物质的量比从1∶1 减小到1∶2 时，挥发油得率不断上升，且当物质的量比为1∶2 时，挥发油得率达到最大值，最利于独活挥发油的提取，但当物质的量比小于1∶2 时，挥发油得率开始下降，这可能是因为物质的量比的不同会影响DESs 的理化性质，在物质的量比为1∶2 时，DESs 与独活之间的氢键相互作用较强，进而促进了独活挥发油的释放[26]。

2.5.2 不同含水量对独活挥发油得率的影响 保证其他实验条件不变，考察DESs 不同含水量（0、10%、20%、30%、40%）对挥发油得率的影响。大部分DESs 与传统有机溶剂相比，黏稠度高，流动性较差，然而添加适量的水会使DESs 分子间的氢键逐渐断裂，可显著降低DESs 的黏度[27-28]。本研究设置5 个DESs 含水量梯度，考察DESs 含水量对独活挥发油得率的影响，结果独活挥发油得率分别为0.50%、0.53%、0.48%、0.45%、0.42%。发现DESs的含水量从0 增加到40%时，DESs 的流动性明显增强，当DESs 含水量从10%增加到40%时，挥发油得率呈下降趋势，且达到最低值；当含水量为10%时，挥发油得率达到最大值，这表明加入适量的水有利于挥发油的提取，可提高挥发油得率，而少量或者过量的水会削弱DESs 的溶解度，进而减弱其与独活的相互作用，导致挥发油得率降低。因此，DESs 含水量为10%时，最利于独活挥发油的提取。

2.5.3 不同微波功率对独活挥发油得率的影响 微波作为一种介质加热模式，可以快速升温，促进分子的振动，进而加速植物细胞纤维素的溶解[29-30]，微波功率是影响挥发油得率至关重要的因素之一。保证其他实验条件不变，考察不同微波功率（300、400、500、600、700 W）对独活挥发油得率的影响。结果独活挥发油得率分别为0.43%、0.50%、0.52%、0.46%、0.35%，当微波功率从300 W 增加到500 W时，挥发油得率不断上升且达到最大值，但当微波功率超过500 W 时，挥发油得率开始呈下降趋势。这可能是因为随着微波辐射的增强，会激发DESs与独活细胞的相互作用，但当微波功率超过500 W时，较高的微波能量会使独活细胞突然破裂，大量的混合物涌出，导致较多挥发性成分难以收集。综上，微波功率为500 W 时最利于独活挥发油的提取。

2.5.4 独活挥发油的最佳提取工艺 通过单因素试验对独活挥发油的提取工艺进行优化，结果表明，最佳提取工艺为HBA 和HBD 的物质的量比为1∶2，微波功率为500 W，DESs 含水量为10%，对此提取条件验证后，独活挥发油提取率为0.54%。与传统的提取方法相比，DES-A-MSD 法具有绿色、环保、低能耗、高产能等优点，这为天然产物中挥发油等活性成分的提取提供了新思路。

2.6 网络药理学分析

选择共有成分作为Q-Marker 的候选化合物，并通过TCMSP 和Swiss Target Prediction 数据库来确定这些候选化合物的靶标，然后利用UniProt 数据库获得了与候选化合物有关的基因信息。将化合物与靶点导入到Cytoscape 3.2.1 软件中，从而创建每个化合物与靶点作用的网络图。利用STRING 数据库，成功地建立了蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络。结合DAVID数据库，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集，并对京都基因和基因组大百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）的通路进行富集分析[31-33]。

2.6.1 Q-Marker 候选成分的选择 基于独活挥发油GC-MS 分析的结果，将不同提取方法下挥发油相对含量较高的主要共有成分作为候选成分，结果见表3。

表3 挥发油质量标志物候选成分Table 3 Candidate ingredients of Q-Marker for volatile oils

2.6.2 候选化合物的靶点预测 查找候选化合物作用靶点和靶点基因名，物种选定为“Human”，以可能性大于0 为筛选标准，得到相应的预测靶点。其中2-羟基环十五酮预测到了100 个靶标，红没药醇预测到了100 个靶标，α-蛇床烯预测到了99 个靶标，β-瑟林烯预测到了23 个靶标，蛇床子素预测到了100 个靶标。将所有靶点取并集、筛去重复值后得到268 个靶点。图2 为成分-靶点网络图（V 形和圆形节点分别表示化合物和对应的靶点，节点大小表示度值大小）；从图中可知，α-蛇床烯、红没药醇、蛇床子素、2-羟基环十五酮对应的靶点更多，影响更大。

图2 成分-靶点网络图Fig. 2 Component-target network

2.6.3 PPI 分析 PPI 是细胞发挥功能的基础，具有调节机体生理病理状态的重要作用[34-35]。使用STRING 数据库对268 个与候选成分相关靶点进行深入分析，设定了蛋白交互参数的评分值超过0.9。将结果以tsv 格式的文件导入到Cytoscape 3.2.1 中，从而构建了PPI 网络（选取degree 大于中位数且大于14 的节点制作PPI 网络图），结果见图3。选取网络中度值（degree）前5 的靶点肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、半胱天冬酶3（caspase 3，CASP3）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG）作为关键靶点。

图3 PPI 网络图Fig. 3 PPI network

2.6.4 GO 与KEGG 富集分析 GO，即基因和蛋白质功能的注释体系，涵盖了3 个独立的本体类别：分子功能（molecular function，MF）、细胞组成（cellular component，CC）以及生物过程（biological process，BP），GO 提升了对基因功能进行预测的准确度。KEGG 将基因、酶、化合物以及代谢和信号通路网络整合在一起，是一个综合性数据库[36]。通过DAVID 数据库，对268 个关键目标靶点执行了GO 功能的富集分析，共获得858 个条目，其中BP 570 个、MF 201 个、CC 87 个，图4 为P＜0.05 的前5 的GO 富集分析条形图。生物过程有胞浆钙离子浓度的正调控、药物反应、疼痛感知等，分子功能有核受体活性、配体激活转录因子活性、锌离子结合等，细胞组成为质膜的组成部分、胞质溶胶等。KEGG 分析获得126 条通路，图5 展示了P值小于0.05 的前9 个重要的KEGG 通路富集分析条形图。这些通路包括了神经活性配体与受体之间的交互作用、癌症途径和钛信号等。

图4 GO 富集分析条形图Fig. 4 Bar chart of GO enrichment analysis

图5 KEGG 富集分析条形图Fig. 5 Bar diagram of KEGG enrichment analysis

2.6.5 成分-靶点-通路网络的构建 图6 为成分-靶点-通路的网络图。参照连接的度值（degree），分析得出红没药醇（连接度为2）和α-蛇床烯（连接度为4）在网络中显示出较高的连接度。因此，红没药醇和α-蛇床烯可以作为挥发油的Q-Marker。5 个关键靶点TNF、MAPK3、ESR1、CASP3 和PPARG 的连接度分别是98、73、65、64 和63，连接度较高，表明这5 个靶点的作用尤为重要；9 条通路中癌症通路的度值是4 为最大值，是最为重要的一条通路。

图6 成分-靶点-通路网络图Fig. 6 Network of component-target-pathway

2.6.6 关键靶点的组织分布 运用The Human Protein Atlas 数据库查找TNF、MAPK3、ESR1、CASP3 和PPARG 5 个核心靶点的组织分布数据，图7 展示了运用Cytoscape 3.2.1 软件构建的靶点-组织网络图。结果显示，MAPK3 与45 个组织相连接、PPARG 与32 个组织相连接、CASP3 与25 个组织相连接、ESR1 与6 个组织相连接、TNF 与5个组织相连接。度值前8 的组织分别是脾（spleen，4）、肺（lung，4）、骨髓（bone marrow，4）、扁桃体（tonsil，4）、甲状腺（thyroid gland，3）、阑尾（appendix，3）、乳房（breast，3）和子宫颈（cervix，3）。关键靶点及其分布的组织与文献所报道的独活挥发油抗炎、抗肿瘤、理气等药理作用相对应。

图7 靶点-组织网络图Fig. 7 Network of target-tissue

2.7 分子对接分析

通过Auto Dock Vina进行分子对接后用PyMOL软件和Discovery Studio 进行可视化分析。

2.7.1 受体与配体结构获取 根据成分-靶点-通路中节点的连接度，选取红没药醇和α-蛇床烯2 个小分子作为配体，选取α-蛇床烯的作用靶点雌激素受体（estrogen receptor 1，ESR1）、过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAPK3）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和红没药醇可作用的靶点ESR1、PPARG 作为受体。从RCSB 数据库下载PDBID 分别为6kn5、5gtn、2zoq 和4y6o 的ESR1、PPARG、MAPK3 和TNF 蛋白[37]。从Pubchem数据库下载小分子红没药醇和α-蛇床烯的3D 结构用来对接。

2.7.2 分子对接与可视化 在PyMOL（4.3.0）软件中分离原始配体和蛋白质结构，在AutodockTools 中对其进行加氢、检查电荷等处理，构建对接网格盒等。使用Auto Dock Vina 进行分子对接，计算ESR1、PPARG、MAPK3 和TNF 与α-蛇床烯组合，以及ESR1、PPARG 与红没药醇对接组合的得分。QMarker 与靶点蛋白结合位置见图8。小分子α-蛇床烯与ESR1、PPARG、MAPK3 和TNF 蛋白之间的结合能分别为-26.8、-30.1、-31.8、-25.1 kJ/mol。小分子红没药醇与ESR1和PPARG蛋白之间的结合能分别为-24.3 和-27.6 kJ/mol。如果小分子与蛋白之间的结合能是负值，且数值越小（＜-20.9 kJ/mol），则表明小分子与靶蛋白之间亲和活性越强[38]，因此，6 对对接小分子和蛋白之间均结合稳定。

图8 分子对接图Fig. 8 Molecular docking diagram

3 讨论

本实验采用SD 法、MASD 法和DES-A-MSD法提取中药独活中的挥发油，分析其化学成分的差异。通过网络药理学预测分析了挥发油的 QMarker。结果表明，DES-A-MSD 法的得油率最高，而MASD 法提取的挥发油含量最高。MASD 法能够更加有效的提取挥发油的Q-Marker，而进一步筛选出更加优异的DESs 用于挥发油的提取，是值得深入研究的课题。

核心靶点TNF、MAPK3、ESR1、CASP3 和PPARG 与独活挥发油Q-Marker 神经保护、抑制相关酶活性、抗肿瘤、理气作用等相关。TNF 能影响胰岛素诱导的机体对葡萄糖的摄取进而控制血糖的迅速升高，还可以在脂肪细胞中诱导GKAP42 蛋白降解进而诱导对胰岛素的抵抗，减缓脂代谢生物过程[39]。MAPK3 主要与癌症和炎症类疾病有关，可以显著降低血管内皮细胞的炎症反应、氧化应激、细胞凋亡[40]。ESR1 对性发育和生殖功能至关重要[41]。CASP3 是重要的抑癌基因，具有重要的生物学功能[42]。PPARG 与PPARA 相似，是结合降血脂药物和脂肪酸的受体，一旦被激活，就可控制脂肪酸的过氧化β途径，是血糖、血脂稳态的关键调节因子[43]。分子对接分析进一步强化了Q-Marker 与其主要靶点间的紧密结合能力，理论上确立了Q-Marker 的显著生物活性。该研究基于独活挥发油提取及其成分含量的测定，探讨了成分与靶点、靶点与组织的联系，并通过分子对接等手段，揭示了独活挥发油潜在Q-Marker 的特性。这为独活挥发油的高效提取和质量控制提供了更全面的参考，也为后期深入研究独活作用机制提供基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突