防风中1 个新多糖的结构及免疫调节活性研究

何新阳，范海涛, ，孙 萌，李 洁，夏 青，姜艳艳, ，刘 斌,

1. 北京中医药大学中药学院，北京 102488

2. 北京电子科技职业学院生物工程学院，北京 100176

3. 齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所，山东 济南 250103

4. 国家中医药管理局“中药经典名方有效物质发现”重点研究室，北京 102488

防风SaposhnikoviaeRadix为伞形科植物防风Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，其性味辛、甘、微温，具有祛风解表、胜湿止痛的功效[1]，可治疗风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风等疾病，是临床常用中药，也是多个常用中成药的主要组成药味，如玉屏风颗粒、防风通圣颗粒、童康颗粒。防风中含有多糖、色原酮、香豆素、挥发油等化学成分，常用于治疗免疫相关疾病，如过敏性鼻炎、慢性支气管炎、过敏性哮喘、肾病等[2-6]。其中，多糖是防风发挥免疫调节作用的主要有效成分。现代药理学研究表明，防风总多糖可有效改善过敏性鼻炎大鼠行为学及鼻黏膜病理形态，显著促进水通道蛋白5（aquaporin 5，AQP5）表达[7]，防风总多糖经硫酸酯化可直接调控肿瘤细胞的恶性生物学行为，发挥免疫调节作用[8]；从防风总多糖中分离得到的均一多糖SDNP-2 对巨噬细胞的免疫抑制有明显的拮抗作用[9]，防风均一多糖SDPs 能清除ABTS 自由基，对H2O2氧化损伤的RAW264.7 细胞具有保护作用[10]。

课题组前期对防风多糖的免疫调节活性开展了系统研究。斑马鱼实验显示，防风总多糖能使斑马鱼的免疫细胞、巨噬细胞和中性粒细胞数目显著增加，有抗炎、抗感染的作用[11]；小鼠碳粒廓清实验表明，防风总多糖能显著提高小鼠免疫器官的脏器指数和免疫球蛋白含量，增强机体非特异性免疫；从防风总多糖中分离得到的均一多糖SP800201 能显著提高细胞的增殖和吞噬能力，对免疫抑制的斑马鱼模型、RAW264.7 巨噬细胞模型均有免疫调节作用[12]。

为进一步阐明防风发挥免疫调节作用的物质基础，探明其作用机制，在前期研究基础上，对防风多糖进行系统分离、纯化，得到新的均一多糖SP800203；采用全水解衍生化、部分酶水解、甲基化以及MS、IR、NMR 谱学等多种方法和技术，对结构进行分析；运用细胞实验、斑马鱼实验，研究其免疫调节活性。本研究为防风的科学应用和进一步开发提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Bruker AVANCE-III HD700 MHz 型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；Agilent 1200 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司OPENLAB 工作站）；UV8000型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪（美国PerkinElmer 公司）；TD5A-WS 型高速离心机（金南仪器制造有限公司）；氮气吹干仪（上海极恒实业有限公司）；ZRQ30型冷冻干燥机（天津因赛科技发展有限公司）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；AR224CN电子天平（美国Ohaus 公司）；TSK®G5000PWXL凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm）和 TSK®G3000PWXL 凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm），日本TSK 公司；HP-5 MS 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国Agilent 公司）；Forma 3111 型水套式CO2培养箱（美国Forma 公司）；SZX16IE204E 型体视荧光显微镜（美国Olympus 公司）；SPX-280B-G型博讯光照培养箱（上海基星生物科技有限公司）；DS-200 高速组织捣碎机（江苏江阴科研器械厂）；细胞超声破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；NanoDrop 2000 紫外分光光度计（美国ThermoFisher 公司）；C1000 Touch 梯度PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；Light Cycler 96 实时荧光定量PCR 仪（瑞士Roche 公司）；Spectra-Max-190 型酶标仪（美国分子仪器公司）；BT-25S 型电子分析天平（北京 Sartorius 公司）；微量移液器（德国Eppendorf 公司）；Sigma3-16P 离心机（德国Sigma公司）；超低温冰箱MOF-U3386S（日本SANYO 公司）；高压蒸汽灭菌锅AUTOCLAVE（日本SANYO公司）；倒置显微镜TE 2000-S（日本Nikon 公司）。

1.2 试剂与药品

系列Dextran 标准品（GPC 分析标准，相对分子质量为1.2×104、2.5×104、5.0×104、8.0×104、2.7×105、4.1×105，美国Sigma aldrich 公司）；单糖标准品D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸（上海金穗生物科技有限公司）、L-阿拉伯糖（天津风船化学试剂科技有限公司）、D-半乳糖醛酸（北京金泰宏达生物科技有限公司）、D-葡萄糖（天津市北联精细化学品开发有限公司）；长春瑞滨（NVB，批号A19GB145811，HPLC 质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；盐酸左旋咪唑（LH，批号C10715718，上海麦克林生化科技有限公司）；中性红（NR，批号BCBC9975，美国Fluka 公司）；苏丹黑B（SBB，批号MKBV5357V，美国Sigma公司）；NO 检测试剂盒（批号S0021S，上海碧云天生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α ， TNF-α ）、 白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6 试剂盒（批号RK00027、RK00006、RK00008，美国 ABclonal 公司）；RAW264.7 巨噬细胞（国家实验细胞资源共享平台）；DMEM 高糖培养基（美国Hyclone 公司）；胎牛血清（澳洲AusGeneX 公司）；CCK-8 试剂盒（美国Genview 公司）；中性红（德国Sigma 公司）；色谱纯甲醇和乙腈（美国Fisher 公司），其余试剂均为分析纯。

防风饮片购自河北华草晟中药材公司，批号2018050601，经北京中医药大学张媛教授鉴定为伞形科防风属植物防风S.divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，药材标本（SD201801）存放于北京电子科技职业学院生物工程学院211 实验室。

1.3 动物

免疫细胞荧光标记的转基因Tg（lyz：DsRed）系斑马鱼和野生型AB 系斑马鱼，由山东省科学院生物研究所药物筛选重点实验室提供，按照明暗14 h/10 h，（28.0±0.5）℃饲养，每天定时定量喂食，选用健康斑马鱼雌雄比例2∶2 于产卵缸中配对产卵，收取受精卵用于实验。BALB/c 雄性小鼠，3～5周龄，体质量（20±2）g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号SCXK（京）2019-0010，饲养于北京中医药大学动物房，动物伦理审查编号为BUCM-4-2020110606-4179，12 h 昼夜循环，室温恒定在22～24 ℃，相对湿度为55%～65%。

2 方法与结果

2.1 防风多糖的提取、分离、纯化

将干燥的防风药材（3 kg）切成小段，10 倍量水（30 L）煎煮2 次，每次1.5 h，滤过，合并滤液。以Sevag 试剂脱蛋白，经紫外可见分光光度计扫描后在280 nm 处无明显吸收峰。滤液加95%乙醇水混合至乙醇浓度为60%，静置，滤过。上清液加95%乙醇水混合至乙醇浓度为80%，静置，滤过。取沉淀，以乙醇（400 mL）、丙酮（400 mL）、乙醚（400 mL）洗涤3 次，即得粗多糖SP80。经DEAE-纤维素阴离子交换色谱柱，以水、线性梯度氯化钠溶液（0～2 mol/L）洗脱，洗脱曲线见图1，在0.2 mol/L氯化钠溶液浓度下洗脱得到SP8002。经Sephadex G-75 柱纯化，以0.01%氯化钠溶液洗脱，即得防风多糖SP800203。

2.2 防风多糖SP800203 的结构表征

2.2.1 相对分子质量分布及糖醛酸含量 采用高效分子排阻色谱法（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）考察均一性。以系列Dextran 为标准品，加NaCl 溶液，以0.45 μm 滤膜滤过，即得标准品溶液，供试品溶液同上述方法制备。经TSK®凝胶色谱柱，分别以0.01% NaCl 溶液、0.02 mol/L 磷酸盐缓冲溶液、0.025 mol/L 硼酸缓冲溶液洗脱，HPLC 检测，通过GPC 软件对多糖的相对分子质量分布进行拟合[13-14]（图2），结果表明防风多糖SP800203 相对分子质量约为7.14×104，均一性良好。采用间羟基联苯法对防风多糖SP800203的糖醛酸含量进行分析，以GalA 为标准品，以吸光度（A）为纵坐标（Y），GalA 含量为横坐标（X），制备标准曲线（图3），将多糖A值代入回归方程，即得防风多糖SP800203 的糖醛酸质量分数为75.73%。

图2 SP800203 的HPLC-SEC 标准曲线和相对分子质量分布图Fig. 2 HPLC-SEC standard curve and molecular weight distribution of SP800203

图3 SP800203 的糖醛酸分析标准曲线Fig. 3 Standard curve for uronic acid analysis of SP800203

图4 单糖标准品 (A) 和SP800203 (B) PMP 衍生化产物的HPLC 图谱Fig. 4 HPLC spectrum of PMP derivatization products of monosaccharide standards (A) and SP800203 (B)

2.2.2 单糖组成 采用HPLC 法分析PMP 全水解衍生化后的样品[15-17]。取L-阿拉伯糖标准品1.0 mg，以水300 μL 溶解，加0.3 mol/L NaOH 溶液、0.3 mol/L PMP 甲醇溶液各400 μL，置烘箱70 ℃保持1 h。冷却，加0.3 mol/L HCl 溶液400 μL，以三氯甲烷600 μL 萃取3 次。取水液，以0.45 μm 滤膜滤过，即得单糖标准品溶液。同法制成半乳糖、葡萄糖等其他单糖的标准品溶液。取防风多糖SP800203 2 mg，加2 mol/L TFA 溶液2 mL，置烘箱115 ℃水解6 h，减压回收溶剂至残渣无明显酸味，以水300μL 溶解，同标准品制备方法制备供试品溶液。经C18色谱柱分离，以乙腈-4.5% NaAc 溶液（78∶22）洗脱，检测并对比供试品与标准品色谱图（图4）即得防风多糖SP800203 的单糖组分为鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）和半乳糖醛酸（GalA），物质的量比为2.8∶6.7∶6∶84.5。

2.2.3 寡糖片段 采用部分酶水解的方法水解防风多糖SP800203，采用ESI-MSn技术对水解产物进行分析。取防风多糖SP800203 1 mg，加50 μg/mL 果胶酶溶液1 mL，40 ℃水浴处理30 min。取酶解液0.3 mL，加甲醇0.9 mL，离心。取上清液，以0.45μm滤膜滤过，即得供试品溶液。经ESI-MSn检测，通过解析母离子的二级质谱，结合裂解规律并参考相关文献报道[18-20]，推断多糖酶水解产物中的寡糖片段，见表1。m/z325.0（C12H21O10，[Gal－Rha－H]-）的二级质谱出现m/z163.0（C6H11O5，[Rha－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段Gal-Rha；m/z339.1（C12H19O11，[GalA－Rha－H]-）的二级质谱出现m/z163.2（C6H11O5，[Rha－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalA-Rha；m/z341.0（C12H21O11，[Gal－Gal－H]-）的二级质谱出现m/z178.7（C6H11O6，[Gal－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段Gal-Gal；m/z354.8（C12H19O12，[GalA－Gal－H]-）的二级质谱出现m/z179.1（C6H11O6，[Gal－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalA-Gal；m/z369.1（C12H17O13，[GalA－GalA－H]-）的二级质谱出现m/z192.7（C6H9O7，[GalA－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段 GalA－GalA；m/z383.1（C13H19O13，[GalAOMe－GalA－H]-）的二级质谱出现m/z193.0（C6H9O7，[GalA－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalAOMe－GalA；m/z559.1（C19H27O19，[GalAOMe－GalA－GalA－H]-）的二级质谱出现m/z383.2（C13H18O13，[GalAOMe－GalAH]-）峰和m/z193.0（C6H9O7，[GalA－H]-）峰，表明多糖中含有寡糖片段GalAOMe－GalA－GalA。

表1 部分酶水解产物中寡糖片段的ESI-MS/MS 峰值以及对应的寡糖片段Table 1 Peak lists in ESI-MS/MS spectra of oligosaccharides by partial enzymatic hydrolysis and their deduced fragments

2.2.4 糖残基类型 采用改良Hakomori 法[21-22]对防风多糖SP800203 进行甲基化分析，采用GC-MS法测定经水解、乙酰化后的甲基化产物，结合文献报道[9,23-24]及CCRC（Complex Carbohydrate ResearchCenter，CCRC）数据库，推断多糖中的糖残基类型。取防风多糖SP800203 5.0 mg，加D2O 5 mL、碳化亚胺200 mg，以0.01 mol/L DCl 溶液调pH 至4.7，室温静置2 h。加2 mol/L NaBD4溶液0.5 mL，室温静置1 h。透析24 h，内液冷冻干燥，备用。重复操作3 次，即得还原多糖。取还原多糖，充氮气后密塞，加甲基亚磺酰甲基钠溶液1 mL，超声波冰浴处理30 min，取出，室温避光静置12 h。置冰水浴，充氮气，加CD3I 1 mL，超声波冰浴处理1 h。淬灭反应，减压回收溶剂，干燥。残渣加水1 mL，以三氯甲烷1 mL 萃取3 次，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂，干燥，备用。重复操作3 次，即得多糖甲基化产物。取多糖甲基化产物以2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液2 mL 溶解，110 ℃水解2 h，减压回收溶剂至残渣无明显酸味。加4% NaBH4溶液1.5 mL，置恒温箱30 ℃保持4 h。加醋酸至无气泡，减压回收溶剂至残渣无明显酸味，置真空干燥箱55 ℃保持 4 h。加无水吡啶、乙酸酐各1 mL，置恒温箱70 ℃保持4 h。室温静置12 h，减压回收溶剂，干燥，残渣加甲醇2 mL 溶解，重复操作3 次，置真空干燥箱55 ℃保持4 h。室温静置12 h，加三氯甲烷1.2 mL，以0.45 μm 滤膜滤过，即得供试品溶液。经HP-5 色谱柱，以GC-MS 分析（图5），程序升温，起始温度100 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 速度升高至270 ℃；进样量1 μL，EI 电离源，源电压70 eV，二级质谱碰撞能12 eV；即得糖残基类型（表2）。

表2 SP800203 的糖残基类型分析结果Table 2 Analysis of sugar residue types for SP800203

图5 SP800203 经甲基化分析的GC-MS 图Fig. 5 GC-MS spectrum of SP800203 analyzed by methylation

2.2.5 糖苷键连接方式 采用IR、NMR 的分析方法，归属各C、H 信号及C、H 相关信号，推断糖苷键的连接方式。

取防风多糖SP800203 适量，与溴化钾粉末研磨均匀，压片，置傅里叶变换红外光谱仪红外扫描（400～4 000 cm-1）。显示有O-H 伸缩振动特征吸收峰（3 398 cm-1），C-H 伸缩振动特征吸收峰（2 946、2 903 cm-1），C=O 伸缩振动特征吸收峰（1 742 cm-1），C-H 变角振动特征吸收峰（1 412、1 331、1 236 cm-1），C-O 伸缩振动特征吸收峰（1 101 cm-1），β-型糖苷键特征吸收峰（915 cm-1），α-型糖苷键特征吸收峰（832 cm-1）。

为了得到箱梁翼缘板的准确正应力，将预应力加在两腹板上的点10位置处，如图1所示，两根钢束的预应力合力大小均为300 N。在ANSYS中利用LINK8单元模拟预应力作用，通过赋予初始应变得到所需预应力。研究初期，也曾用等效荷载加在同一位置处，提取的结果和用LINK8单元算出来的结果进行对比分析，最后发现误差较小，说明用LINK8单元模拟纵向预应力筋是准确的。跨中施加的集中荷载P亦可模拟车轮荷载作用下在跨中的等效集中力。

取防风多糖SP800203 30 mg，以D2O 0.6 mL溶解，冷冻干燥，重复操作3 次。以D2O 0.6 mL 溶解，于44.85 ℃进行NMR 分析，记录1H-NMR、13CNMR、1H-1H COSY、HSQC 和HMBC 图谱。在防风多糖SP800203 的1H-NMR 谱中（图6），δH5.50～4.70 显示糖的H-1（端基氢）信号，δH4.70～3.05 显示糖的非端基氢信号；δH5.10 为吡喃型阿拉伯糖的H-1 信号，δH5.43 为呋喃型阿拉伯糖的H-1信号，δH4.72 为→3) Rhap(1→的H-1 信号，δH5.29为→2) Galp(1→的H-1 信号，δH5.24 为→2)GalAp(1→的H-1 信号，δH5.03 为→3) Galp(1→的H-1 信号，δH5.08 为→4) GalAp(1→和→2,3) GalAp(1→重叠的H-1 信号；δH4.47、4.44 为→2) Galp(1→亚甲基的氢信号，δH4.46、4.39 为→3) Galp(1→亚甲基的氢信号，δH1.40 为→3) Rhap(1→甲基的氢信号。

图6 SP800203 的1H-NMR 谱 (A) 和13C-NMR 谱 (B)Fig. 6 1H-NMR spectrum (A) and 13C-NMR spectrum (B) of SP800203

在防风多糖SP800203 的13C-NMR 谱中（图6），δC104.0～95.0 显示糖的C-1（端基碳）信号，δC82.0～60.0 显示糖环上的碳信号；δC95.4 为呋喃型阿拉伯糖的C-1 信号，δC100.8 为吡喃型阿拉伯糖的C-1 信号，δC99.4 为→3) Rhap(1→的C-1 信号，δC103.4 为→2,3) GalAp(1→的C-1 信号，δC103.3为→4) GalAp(1→的C-1 信号，δC103.2 为→3) Galp(1→的C-1 信号，δC102.4 为→2) Galp(1→的C-1信号，δC102.6 为→2) GalAp(1→的C-1 信号；δC19.8 为→3) Rhap(1→的C-6（甲基碳) 信号，δC173.9 附近为糖醛酸的C-6（羰基碳）信号。

在防风多糖SP800203 的1H-1H COSY 谱中（图7），δH/H5.43/3.93 为Araf(1→的H-1/H-2 相关信号，δH/H5.10/4.09 为Arap(1→的H-1/H-2 相关信号，δH/H4.72/4.09为→3) Rhap(1→的H-1/H-2相关信号，δH/H5.24/4.52 为→2) GalAp(1→的H-1/H-2 相关信号，δH/H5.29/4.11 为→2) Galp(1→的H-1/H-2 相关信号，δH/H5.03/3.07为→3) Galp(1→的H-1/H-2相关信号，δH/H5.08/3.86 为→4) GalAp(1→的H-1/H-2 相关信号，δH/H5.08/4.58 为→2,3) GalAp(1→的H-1/H-2 相关信号；δH/H4.74/4.09 为→3) Rhap(1→的H-2/H-3相关信号，δH/H4.58/4.13 为→2,3) GalAp(1→的H-2/H-3 相关信号，δH/H4.52/4.11 为→2) GalAp(1→的H-2/H-3 相关信号，δH/H4.34/4.11 为→2) Galp(1→的H-2/H-3 相关信号。

图7 SP800203 的1H-1H COSY 谱Fig. 7 1H-1H COSY spectrum of SP800203

在防风多糖SP800203 的HSQC 谱中（图8），δC/H95.4/5.43 为Araf(1→的C-1/H-1 相关信号，δC/H100.8/5.10 为Arap(1→的C-1/H-1 相关信号，δC/H99.4/4.72 为→3) Rhap(1→的C-1/H-1 相关信号，δC/H102.6/5.24 为→2) GalAp(1→的C-1/H-1 相关信号，δC/H102.4/5.29 为→2) Galp(1→的C-1/H-1 相关信号，δC/H103.2/5.03 为→3) Galp(1→的C-1/H-1 相关信号，δC/H103.3/5.08 为→4) GalAp(1→的C-1/H-1相关信号，δC/H103.4/5.08 为→2,3) GalAp(1→的C-1/H-1 相关信号。具体碳氢相关信号归属见表3。

表3 SP8002031H-NMR 和13C-NMR 的信号归属Table 3 1H- and 13C-NMR chemical shift assignments of SP800203

图8 SP800203 的HSQC 谱Fig. 8 HSQC spectrum of SP800203

在防风多糖SP800203 的HMBC 谱中（图9），δC/H73.3/5.24 为→2,3) GalAp(1→的C-3 和→2)GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2)GalAp(1→3) GalAp(2) (1→结构片段的重复单元；δC/H81.4/5.24 为→3) Galp(1→的C-3 和→2) GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2) GalAp(1→3) Galp(1→结构片段的重复单元；δC/H81.5/5.10为→2) GalAp(1→的C-2 和Arap(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在Arap(1→2) GalAp(1→结构片段的重复单元；δC/H81.5/5.08 为→2) GalAp(1→的C-2 和→2,3) GalAp(1→的H-1、→2) GalAp(1→的C-2 和→4) GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2,3) GalAp(1→2) GalAp(1→和→4) GalAp(1→2) GalAp(1→结构片段的重复单元；δC/H73.3/5.08 为→2,3) GalAp(1→的C-3 和→4)GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→4)GalAp(1→3) GalAp(2) (1→结构片段的重复单元；δC/H81.4/5.03 为→3) Galp(1→的C-3 和→3) Galp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→3) Galp(1→3) Galp(1→结构片段的重复单元；δC/H80.0/5.03 为→3) Rhap(1→的C-3 和→3) Galp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→3) Galp(1→3) Rhap(1→结构片段的重复单元；δC/H103.4/4.58 为→2,3) GalAp(1→的 C-2 和→2,3)GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2,3)GalAp(1→2) GalAp(3) (1→结构片段的重复单元；δC/H102.6/4.58 为→2,3) GalAp(1→的C-2 和→2)GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2)GalAp(1→2) GalAp(3) (1→结构片段的重复单元；δC/H102.6/4.52 为→2) GalAp(1→的C-2 和→2)GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2)GalAp(1→2) GalAp(1→结构片段的重复单元；δC/H102.6/4.51 为→4) GalAp(1→的C-4 和→2) GalAp(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→2) GalAp(1→4) GalAp(1→结构片段的重复单元；δC/H95.4/4.51 为→4) GalAp(1→的C-4 和Araf(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在Araf(1→4) GalAp(1→结构片段的重复单元；δC/H99.4/4.13 为→2,3)GalAp(1→的C-3 和→3) Rhap(1→的H-1 相关信号，表明在多糖中存在→3) Rhap(1→3) GalAp(2)(1→结构片段的重复单元。以上糖残基信号归属及连接关系见表4。

表4 SP800203 HBMC NMR 信号归属及糖残基连接关系Table 4 HMBC NMR spectral data and connected relations of residues of SP800203

图9 SP800203 的HMBC 谱Fig. 9 HMBC spectrum of SP800203

结合以上测定结果，可以推测防风多糖SP800203 的结构见图10。

图10 SP800203 的结构式 (R1 和R2 为多糖支链)Fig. 10 Putative structure of SP800203 (R1 and R2 mean branches in polysaccharide)

2.3 防风多糖SP800203 免疫调节活性

表5 SP800203 对巨噬细胞NO、TNF、IL-1β 和IL-6 含量的影响Table 5 Effects of SP800203 on content of NO, TNF, IL-1β and IL-6

2.3.2 防风多糖SP800203 对斑马鱼免疫细胞的影响 参照文献方法[11]，以免疫细胞荧光标记的转基因斑马鱼Tg（lyz：DsRed）和野生型AB 系斑马鱼为实验动物，选用长春瑞滨诱导免疫低下模型，分别通过荧光和中性红染色法检测空白组、模型组、阳性对照组、给药组斑马鱼体内免疫细胞密度和巨噬细胞数目，结果见表6。与空白组相比，模型组（免疫低下模型）的免疫细胞密度、巨噬细胞数目显著降低；与模型组相比，防风多糖SP800203 各浓度组免疫细胞密度、巨噬细胞数目显著上升，具有一定的免疫调节活性。

3 讨论

防风多糖SP800203 为自防风中分离得到的新的均一多糖，相对分子质量约为7.14×104，糖醛酸质量分数为75.73%，由鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸组成，单糖物质的量比为2.8∶6.7∶6∶84.5。主链由半乳糖醛酸聚合而成，通过β、α 糖苷键相连，2 条支链分别由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖、鼠李糖，以及阿拉伯糖、半乳糖醛酸、半乳糖聚合而成，二者分别通过β、α 糖苷键与主链相连。采用细胞实验和斑马鱼实验研究防风多糖SP800203的免疫调节活性，结果显示，防风多糖SP800203 能够显著促进巨噬细胞释放NO、TNF-α、IL-1β 和IL-6，使免疫细胞密度、巨噬细胞数目显著上升，有一定的免疫调节活性。该结果丰富了防风多糖的研究成果，为阐明防风多糖免疫调节作用机制奠定基础，为防风的进一步开发和应用提供了科学依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突