达格列净预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响*

林 伟 熊尚全 刘 芳 詹 萍 李翠云 林 超 林飞宁

1 福建中医药大学附属人民医院,福建省福州市 350000; 2 福建医科大学附属福州儿童医院

急性心肌梗死病情危重,及时给予再灌注治疗,恢复心肌的血液灌注是治疗急性心梗的关键措施。再灌注治疗可以通过经皮冠状动脉介入治疗(PCI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)和药物溶栓来完成。然而,再灌注治疗会引起心肌缺血—再灌注(I-R)损伤[1-2],加剧心肌细胞的坏死与凋亡。因此,怎样减少I-R损伤是科学研究的重点。提前给予药物干预是在缺血预处理的背景上发展起来的,它能激发机体内源性防护机制来对抗I-R 损伤,具有重要的临床意义。作为一种新型降糖药物,钠—葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂(SGLT-2i)发挥重要的作用,该类型药物包括卡格列净、达格列净等,可以对钠离子等进行重吸收,让肾小管能够排出大量的葡萄糖,从而让机体血液中的葡萄糖水平能够降低[3]。在让血糖水平降低的同时该类药物同时兼有保护肾脏、降血压、降血脂等作用。其中,以达格列净为代表,根据相关研究资料可以明确,该类型药物可以让复合心血管事件、全因死亡率等得到有效降低。SGLT-2i可促进尿糖的排出,从而降低葡萄糖毒性和体重,并增强利钠,从而降低血压,减少心力衰竭患者总病死率,还可对其肾脏疾病的发展产生延缓效果[4-5]。鉴于达格列净有心血管保护作用,本文以糖尿病大鼠作为样本,研究达格列净对心肌I-R损伤的影响,对其作用机制进行探讨,为探求保护心肌I-R损伤的临床药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物:雄性糖尿病(SD)大鼠24只,平均体重270g,均为孚生物技术有限公司提供。选择购买碧云天公司的TUNEL试剂盒;(2)试剂仪器:购买Meilunbio公司的TTC,Sigma公司的伊文思蓝;购买由阿斯利康制药有限公司生产的达格列净,批号NH3264。购买Olympus公司CKX-3显微镜,购买北京北瑞未来科技有限公司TKR-200C小动物呼吸机。

1.2 方法

1.2.1 分组。实验动物随机分3 组,每组8 只:(1)假手术组: 开胸后仅在LAD下穿线不结扎;(2)达格列净预处理组:在给予结扎之前连续1个月口服给药,每天给药1次,根据体重给药(1mg/kg),随后结扎LAD,时间为0.5h,2h为灌注时间; (3)I/R组:0.5h为结扎LAD时间,2h为灌注时间,无其他药物处理。连续监测肢体Ⅱ导联心电图,观察心率及ST段改变,用伊文斯蓝等对缺血和梗死面积进行检测,对心肌细胞AI进行检测。

1.2.2 模型建立。以参照文献[6-7]介绍的方法为基础构建模型,糖尿病SD大鼠经腹腔注射麻醉,仰卧固定四肢与头部,颈部正中去毛,纵向做一0.5cm切口,暴露出气管,插入大小合适的气管套管并接呼吸机(频率70次/min,潮气量1.5ml/100g,吸呼比为1∶1.5)。左颈部做一约0.5cm切口,钝性分离皮下组织,直到露出左侧颈静脉,穿刺左颈静脉,插入一根静脉留置针备用并固定。左侧胸部第3～4 肋间去除体毛,并做一长约2cm的纵形切口,钝性分离胸大肌,直到露出肋骨,分离第3或第4肋间肌,再用小型拉钩分开肋间,以眼睑撑开器分开并固定,切开心包,彻底暴露心脏,找到肺动脉圆锥和左心耳,在左心耳根部下方约2mm处用8-0 Prolene线穿针通过,穿针深度通过心肌约1mm,进出针眼间距1.5～2mm。采用打活结法,对LAD进行可逆性结扎,让心肌在0.5h中处于缺血状态,把丝线解开,继续2h灌注。开始实验时将针式电极穿入大鼠四肢皮下,尾部连接到心电图相对应的肢导联线上,描记心电图Ⅱ导联。以左室前壁出现紫绀或蓝紫色,同时心电图提示ST段抬高0.2mV以上,QRS 幅度变宽升高作为大鼠LAD准确结扎的标准;以ST段回落1/2以上,缺血区紫绀或蓝紫色消失作为冠状动脉再通的标志。操作过程中,如果出现室颤等,或未到时间就死亡的大鼠,就抛弃不用,直至达到实验目标数。

1.3 观察指标

1.3.1 生化指标测定。缺血再灌注2h后,从左颈静脉抽出2ml血,加到促凝管中,在室温下放置1h,后3 000r/min离心5min,取上层血清,保存在-20℃冰箱中,3～8h内用LDH测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号A020-2-1)、大鼠CK-MB ELISA试剂盒(批号MM-0625R2)对血清相关指标进行检测。

1.3.2 测定心肌梗死和缺血范围。完成上述操作之后原位结扎,把伊文氏蓝注入静脉,把非缺血心 肌染成蓝色,从而显示出缺血区心肌。切去除左心室外的心脏其他部分,按垂直于左心室长轴方向做病理切片(厚1～2mm),将其放入pH 7．4,浓度2%的TTC磷酸缓冲液中,孵育,时间为20min,温度为37℃。红色区域为非梗死区,灰白色区域为梗死区,对照片进行拍摄,对不同部分的面积进行分析。以危险区面积与左心室面积(LV)的比值(AAR/LV)表示危险区面积;梗死面积为每一心脏总梗死区面积与总危险区面积的比值(AN/AAR)。

1.3.3 原位末端标记(TUNEL)测定凋亡心肌细胞。应用TUNEL法测定缺血区心肌细胞凋亡指数。在进行测试的时候以说明书要求为基础进行。测定凋亡指数的时候需要对切片阳性细胞视野进行随机抓拍,对凋亡阳性核的个数及细胞总数进行计算,数据以均数±标准差表示,按细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

2 结果

2.1 达格列净对心肌I/R后CK-MB、LDH的影响 与假术组相比,缺血再灌注后大鼠血清CK-MB、LDH明显升高;达格列净组与I-R组相比,心肌酶水平明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠CK-MB和LDH水平比较

2.2 达格列净预处理可有效减少MI面积 除假手术组外,各组心肌危险区面积无显著性差异(P>0.05);与I-R组相比,达格列净组心肌梗死面积明显减小(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠心肌梗死面积比较

2.3 达格列净预处理可有效减少I-R心肌细胞的凋亡 凋亡阳性心肌细胞核呈现棕褐色 ,不规整碎点状 ,大小形态不一;细胞如果没有凋亡则具有较大并且蓝色的细胞核。凋亡细胞在假手术组很少见(见图1a);I-R组较多见(见图1b),AI为(38.5±1.9)%;与I-R组相比,达格列净组(见图1c)凋亡细胞相对减少(P<0.05),AI为(28.4±1.4)%。

图1 大鼠心肌组织切片TUNEL染色(×200)

3 讨论

当机体冠状动脉出现不稳定斑块破裂等情况并形成血栓的时候可导致该处血管血流中断,严重时可导致心肌发生坏死,在对该类型患者进行治疗的时候,再灌注是治疗该病的重要手段,它可使缺血心肌组织再次获得血液灌注,为缺血心肌细胞提供必要的营养成分,恢复其正常的结构和功能。但是,在给予患者该类型治疗时部分患者并没有有效改善缺血性损伤,反而导致损伤进一步加剧[8-9]。本研究结果表明,对比I-R组可以发现,给予其达格列净预处理可让损伤得到显著改善,这是因为该药物让乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶的释放水平降低,进而可以让心肌梗死面积显著减少。

Murry等[10]首先提出了缺血预处理的概念,分析该概念可以明确,其是指利用信号传导等方式对再灌注损伤进行改善[11],虽然该方式得到一定的认可,但是临床上并没有广泛采用缺血预处理的方式,原因是这种抗损伤机制如果想要形成,首先需要接受缺血预适应损伤,因此导致研究者在对其进行研究和分析的时候选择使用药物进行模拟。药理预处理的优点是操作简便、无明显创伤,是一种切实可行的临床治疗策略。武卫党等人[12]研究表明:在对大鼠心肌功能进行研究和分析的时候,达格列净可对其产生显著的改善效果,可让相关血管与心肌功能得到有效恢复。也有研究的学者认为:患有2型糖尿病的患者往往具有较高的心血管死亡发生概率,同时还具有较高的心力衰竭发生概率。如果给予患者达格列净治疗,这些患者同时出现两种预后的风险可能会降低[13]。以上研究提示达格列净可能改善心肌缺血,但能否减轻心肌I-R损伤并不明确,目前这方面研究相对较少,所以本研究以大鼠作为样本,对和人类类似的心肌缺血再灌注模型进行构建,采用达格列净预处理的方式,研究其和心肌损伤之间的关系。

SGLT-2i是一类新型的降血糖药物,它抑制钠—葡萄糖协同转运蛋白2的作用机理与以往的降血糖药物不同,该药物在发挥作用时可对Na+等产生影响,使其重吸收过程受到阻碍,进而让肾小管排出大量葡萄糖,让机体血液中糖水平降低[3]。在降低血糖的过程中使用该药物同时兼有保护肾脏、降血压、降血脂等多方面的作用。其中,以达格列净为代表,能在一定程度上降低糖尿病患者的心血管事件发生概率,该类型药物在降低血糖与胰岛素浓度后,会增加脂肪的分解,促进脂肪酸转化成酮类,而酮类物质能加快能源的释放来满足心肌运动时的能量消耗。SGLT-2i可促使心力衰竭患者的心肌代谢功能的紊乱得到改善,当心肌收缩功能下降时,可降低支链氨基酸代谢对丙酮酸利用率的影响和I-R损伤;它能减少肌细胞膜相关交换泵的活性,降低细胞中的Na+水平[14]。该药物还有正性肌力作用,之所以有该情况出现,可能是因为在机体使用该药物之后能够小幅度提升胰高血糖素水平[15]。

对其他研究学者研究成果进行研究和分析,可以发现该药物通过以下几个方面发挥作用:(1)抑制钠氢转运体(NHE-1)的活性:包括卡格列净、达格列净、恩格列净在内的多种SGLT-2i均已被研究证明可抑制NHE-1活性,从而降低心肌细胞内Na+浓度,减少Na+-Ca2+交换,减轻细胞内的Ca2+负荷,降低钙超载带来的损伤[16]。(2)改善线粒体功能:在缺氧情况下,细胞内ATP和氧分压的下降会导致线粒体氧化磷酸化功能障碍,电子传递链受损,而SGLT-2i曾被证实可以维持H/R干预下H9c2细胞内的ATP水平,增强细胞活力[17]。(3)调节P13K/AKT信号通路减少细胞凋亡:SGLT-2i被证实可直接将多种细胞系中蛋白激酶(AMPK)Thr172磷酸化,在下游通路中,也可见其对内皮一氧化氮合酶(eNOS)及蛋白激酶(Akt)的磷酸化作用,在缺血损伤模型中,Akt等物质的激活可抑制下游促凋亡蛋白(如Bax等)的表达,从而发挥心肌保护作用[18-19]。

综上所述,达格列净预处理可能通过抑制NHE-1的活性,改善线粒体功能,对相关信号通路进行调节,使梗死面积减少,细胞凋亡水平、乳酸和肌酸激酶同工酶水平降低,起到对I-R 心肌的保护作用。