半枝莲含药血清对膀胱癌T24细胞凋亡和黏附力的影响探究*

孙业香 王潇潇 王丽华 吕常旭

烟台南山学院,山东省龙口市 265713

膀胱癌是临床最常见的泌尿系统恶性肿瘤,也是全球最普遍的癌症之一[1]。据全球癌症负担统计,全世界每年诊断超过18万新发癌症病例,其中3.0%的新发癌症诊断和2.1%的癌症死亡是由膀胱癌引起的,且随着世界人口结构的变化及各种不同风险因素的变化,其发病率和死亡率也随之变化[2]。膀胱癌具有多发性、多器官和易复发的特点,即使经规范化治疗,仍有较高的复发率,且本病的病因复杂,涉及基因、蛋白、代谢等因素对癌细胞生长、侵袭、凋亡等生命活动的影响[3]。近年来,越来越多的学者从影响癌细胞生命活动方面进行研究,以期为膀胱癌的治疗寻找新的方向和靶点。半枝莲为唇形科植物半枝莲的干燥全草,中医认为其具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛等多种功效,并具有抗癌作用[4-5],但其具体的抗癌机制及对膀胱癌细胞的作用仍有待进一步探究。本研究使用膀胱癌T24细胞株研究半枝莲含药血清对其凋亡及黏附力的影响,为半枝莲在膀胱癌中的治疗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞。SPF级雄性Wistar大鼠(中山大学,粤SCXK2021-0029),体重240～260g,6～8周龄;人膀胱癌T24细胞株(中山大学生命科学院细胞库)。

1.1.2 药品与试剂。半枝莲提取物(10∶1水提物,兰州沃特莱斯生物科技有限公司);10%胎牛血清、RPMI-1640培养基(Gibco,内蒙古奥普赛生物科技有限公司);胰蛋白酶(北京索宝来公司)3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑蓝(MTT);DMSO溶液(Sigma公司);兔源一抗B-细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗体、Bcl-2关联X蛋白(Recombinant Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗体、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)蛋白、二抗羊抗兔IgG(英国Abcam公司);CytoFLEX S流式细胞仪(贝克曼库尔特有限公司,中国),Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);Fresco21离心机(赛默飞世尔科技有限公司,中国);FYL-YS-430L电热恒温孵育箱(北京福意电器有限公司);DM IL KED倒置荧光显微镜(徕卡显微系统贸易有限公司,上海);低温冰箱(中国海尔公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养。人膀胱癌T24细胞于10%胎牛血清、1%青/链霉素的RPMI-1640培养基置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养,2～3d换液1次,至细胞融合至70%～80%用0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 含药血清制备[6]。Wistar大鼠适应性饲养1周后编号,随机分为无药血清组、半枝莲低剂量组、半枝莲中剂量组、半枝莲高剂量组,5只/组,半枝莲低、中、高剂量组分别以1.5g/(kg·d)、3g/(kg·d)、6g/(kg·d)(加入10ml蒸馏水制成混悬液)灌胃,2次/d,连续灌胃3d。无药血清组采用蒸馏水灌胃,2次/d。末次灌胃后2h将大鼠以30mg/kg、3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,固定于手术台,使用注射器经右心室抽血,室温下静置凝固,2 400r/min离心10min,分离上层血清,灭活处理后以0.22μm的微孔滤膜无菌过滤后于-20℃冰箱保存。

1.2.3 细胞分组及干预。对数生长期人膀胱癌T24细胞分为无药血清组、半枝莲低剂量组、半枝莲中剂量组、半枝莲高剂量组,以10%大鼠血清(各组细胞对应各组大鼠)培养,分别于24h和48h两个时间点采用流式细胞仪检测各浓度下T24细胞的凋亡率,实验均重复3次。

1.2.4 细胞增殖情况。对数生长期T24细胞,以胰酶消化重悬,1×103个/孔接种于96孔板中恒温培养,设置5个复孔,加入培养基100μl,于培养24h、48h时每孔加入CCK-8溶液10μl,在细胞培养箱中继续培养4h,以酶标仪测定450nm处吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率=[1-(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]×100%。

1.2.5 细胞凋亡情况。对数生长期细胞以胰酶消化重悬,4×103个/孔接种于6孔板中恒温培养,流式细胞仪技术检测T24细胞的凋亡周期变化。

1.2.6 细胞黏附力情况。96孔培养板预铺Matrigel基质胶每孔10μg/50μl,于超净台内风干。96孔板中加入含有2%的BSA培养基,100μl/孔,细胞培养箱内封阻1h,PBS冲洗,加入各组细胞混悬液100μl/孔,每组5个复孔,培养48h,弃培养液,PBS洗涤,去掉未黏附细胞,加入EPMI-1640培养基及MTT溶液各50μl,继续培养4h,每孔加入150μl DMSO,震荡10min,于酶标仪上检测570nm波长处的吸光度(A)值。细胞黏附率=[1-(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值]×100%。

1.2.7 凋亡相关蛋白表达。取各组培养48h后的T24细胞,PBS洗涤,离心收集上清,4℃环境下12 000r/min离心20min,弃上清液提取细胞蛋白,加入上样缓冲液混匀,水浴变性,检测蛋白浓度,以12%SDS-PAGE电泳,转膜,5%脱脂奶粉封闭2h,TBST洗涤,加入Bcl-2、Bax、Caspase-3及内参蛋白GAPDH一抗孵育液,4℃孵育过夜,TBST洗涤,加入二抗孵育2h,TBTS洗涤,显色、成像使用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 半枝莲含药血清对膀胱癌T24细胞增殖影响 各组细胞24h及48h的增殖抑制率比较,差异有统计学意义(P<0.05);均为:半枝莲高剂量组>半枝莲中剂量组>半枝莲低剂量组>无药血清组(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

2.2 半枝莲含药血清对膀胱癌T24细胞凋亡影响各组细胞凋亡率以及细胞周期G0/G1期、S期、G2期比较,差异有统计学意义(P<0.05);凋亡率、GO/G1显示:无药血清组<半枝莲低剂量组<半枝莲中剂量组<半枝莲高剂量组(P<0.05);S、G2显示:无药血清组>半枝莲低剂量组>半枝莲中剂量组>半枝莲高剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组细胞凋亡及周期情况比较

2.3 半枝莲含药血清对膀胱癌T24细胞黏附力影响 各组细胞黏附率比较,差异有统计学意义(F=85.362,P<0.001),即无药血清组(27.22±4.20)%<半枝莲低剂量组(35.66±5.41)%<半枝莲中剂量组(45.44±6.58)%<半枝莲高剂量组(56.50±8.42)%(F=19.662,P<0.05)。

2.4 半枝莲含药血清对膀胱癌T24细胞凋亡相关蛋白表达影响 各组细胞Bcl-2、Bax、CASP3相对表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05);Bcl-2显示:无药血清组>半枝莲低剂量组>半枝莲中剂量组>半枝莲高剂量组(P<0.05);Bax、CASP3显示:无药血清组<半枝莲低剂量组<半枝莲中剂量组<半枝莲高剂量组(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞凋亡相关蛋白表达比较

3 讨论

在恶性肿瘤的发生发展过程中,癌细胞的凋亡、侵袭、转移是病情进展及预后不佳的重要因素。凋亡是细胞自身调节的一种机制,在肿瘤中发挥重要的调节作用,可以防止肿瘤细胞的过度增生和扩散,并促进肿瘤细胞的死亡和清除[7]。侵袭和转移是肿瘤增殖生长和远处转移的特性,与治疗效果及预后息息相关,细胞与其周围基质间的黏附情况是影响其侵袭能力的重要因素[8]。因此,促进癌细胞凋亡,增加其黏附力,从而抑制侵袭、转移在恶性肿瘤的治疗中有重要作用。

目前靶向治疗为恶性肿瘤的重要治疗方式之一,关于膀胱癌的靶向治疗药物有BGJ398、多韦替尼、厄达替尼等,但存在药物安全性及治疗准确性等问题。随着中医药在癌症治疗中研究的深入,中草药被证实能从多层面、多环节和多部位发挥明显的多靶点效应,成为恶性肿瘤靶向治疗的研究热点。半枝莲属中医药中清热解表药物,其性温、苦、寒,归肺、肾经,具有清热解毒、活血化瘀及利水消肿的作用[9]。现代药理研究表明,半枝莲中含有黄酮类、二萜类、二萜内酯类及多糖等化学成分,具有解热、镇痛、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫调节、护肝等多种作用[10],因此被应用于癌症的相关研究。目前关于含有半枝莲的中药复方制剂及半枝莲有效成分的抗癌作用已有较多研究,但关于其在人前列腺癌方面的研究较少。张峰等在体外细胞研究发现,半枝莲总黄酮能上调迁移侵袭蛋白的表达,抑制人胃腺癌细胞的增殖、诱导细胞凋亡,提高其放疗敏感性[11]。刘明胜等将半枝莲醇提取物应用于结直肠癌细胞HCT-116,结果表明半枝莲醇提取物能抑制结直肠癌细胞的克隆形成,促进凋亡,其机制可能与调控circ_0092283/miR-198通路有关[12]。亦有相关研究证实半枝莲及其相关提取物在乳腺癌、肝细胞癌中均发挥良好的抗癌效果[13-14]。本研究中,与无药血清组比较,半枝莲低/中/高剂量组的增殖抑制率、凋亡率且其变化程度与剂量有明显的关系,这说明半枝莲含药血清可抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,提高细胞与基质间的黏附力,有明显的体外抗膀胱癌活性。

细胞的凋亡受细胞凋亡调节蛋白和细胞存活调节蛋白平衡的影响。Bcl-2家族蛋白在线粒体介导的内在细胞凋亡途径中有重要作用,在癌细胞中属于抗凋亡蛋白,其过度表达能增强细胞对细胞毒素的抵抗性,抑制多数肿瘤化疗药物引起的靶细胞凋亡[15]。Bax亦属于Bcl-2家族成员,为促凋亡蛋白,能引起线粒体外膜的透化触发细胞凋亡,细胞中的Bax蛋白被激活后可释放凋亡信号因子,促进细胞凋亡[16]。Bcl-2与Bax的比值失衡则可造成细胞的过度凋亡或过度增殖,影响细胞的发生发展。CASP3是保守蛋白质家族中广泛表达的成员,能特异性地切割天冬氨酸残基上的肽键,引起细胞凋亡,是多种细胞动物体内所有凋亡蛋白中的主要执行对象,直接参与调控凋亡,导致细胞染色质浓缩、被吞噬敏感性增加[17]。本研究中经半枝莲含药血清干预的各组细胞G0/G1期、Bax与CASP3相对表达量增加均增加,细胞S期、G2期及Bcl-2蛋白相对表达量均下降,且呈剂量依赖性,说明半枝莲含药血清能在体外将膀胱癌T24细胞阻滞于G0/G1期,诱导细胞的凋亡,与既往对半枝莲抗癌作用研究的特性相符。赵鸿翔等[18]进行的动物实验表明,雄性SD大鼠脑室内注射β淀粉样蛋白25-35、三氯化铝及重组人转化生长因子,能引起线粒体凋亡因子Bcl-2、Bax、Bal-xL及Bak的异常改变,半枝莲黄酮能逆转这一改变,可说明半枝莲能通过增加Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,促进人膀胱癌T24细胞的凋亡,抑制其增殖,发挥相关抗癌作用。

综上所述,半枝莲含药血清能抑制人膀胱癌T24细胞的增殖,诱导凋亡,提高细胞黏附力,可作为抗膀胱癌药物进行研究。本研究的不足之处在于仅从细胞实验方面验证了半枝莲在对人膀胱癌T24细胞的抗癌作用,后续仍需进一步建立动物皮下移植瘤模型,深入进行多机制探讨,为膀胱癌的防治研究提供更加全面的参考。