艾叶总黄酮提取工艺优化和抗氧化活性的初步探究

张小凤，曾颖欣，周丽萍，黄丽华，凌海燕

肇庆学院，广东 肇庆 526061

现代药理研究表明，艾叶中富含的黄酮类化合物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性[1]。本篇初步探究艾叶黄酮类化合物的提取方法及其相应的抗氧化活性作用，以期为进一步优化提取艾叶中黄酮类化合物的工艺条件和抗菌活性作用的研究提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

艾新鲜叶片：采摘于肇庆学院生物园。纯水、DPPH、芦丁标准品、磷酸缓冲液（0.2 mol/L）、无水乙醇、TCA、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、K3[Fe（CN）6]、FeCl3、CH3OH、FeSO4、H2O2、C7H6O3等。

电热鼓风干燥箱、粉碎机、电子天平、超声波清洗器、可见分光光度计、循环水真空泵等。

1.2 方法

1.2.1 工艺提取流程

将艾叶清洗、擦干，称量其鲜重（FW）；烘干，称量其干重（DW）；按以下公式计算艾叶含水量（WC）：

艾叶粉碎→称取粉末→加入乙醇溶液→浸泡4 h→超声波提取→减压抽滤→艾叶总黄酮提取液→进行含量测定和抗氧化活性测定及分析。

1.2.2 艾叶黄酮的提取

保持其他条件不变，测定艾叶黄酮的提取量受浸取液乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g/mL）、超声提取时间（10、20、30、40、50 min）各因素的影响。

为减少繁多的实验次数，使用以单因素实验为基础的正交法，选择不同的正交试验因素与水平，详见表1，以此优化提取工艺条件并进行相应的验证实验。

表1 正交试验因素与水平

1.2.3 艾叶黄酮含量的测定

标准曲线的制作以芦丁标准品为试样，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法并测定吸光度值，绘制芦丁标准曲线。

取不同提取条件处理的0.5 mL 艾叶黄酮提取液，将其移到25 mL 容量瓶里并加入6 mL 纯水，艾叶黄酮的测定同样按照比色法测定其吸光度值，艾叶黄酮的含量可代入得到的芦丁标准曲线回归方程中算出。

1.2.4 艾叶黄酮的抗氧化活性

测定不同质量浓度（0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的艾叶黄酮对DPPH·清除能力的吸光度值，并参考黄丽华等[2]文献中DPPH·清除率公式计算。黄酮对·OH 清除能力的测定。测定不同质量浓度（0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的黄酮提取液对·OH清除能力的吸光度，并参考黄丽华等[2]文献中·OH清除率公式计算。

2 结果与分析

2.1 艾叶含水量测定

植物的水分状况对植物的生理活动有着极重要的影响，植物的含水量是衡量植物生长的重要指标之一。测量艾叶的含水量，取平均值，得到艾叶含水量为85.8%。

2.2 芦丁标准曲线

经测定，变量为芦丁质量浓度c（mg/mL），随机变量为吸光度A，绘制芦丁标准曲线，如图1，可得回归方程：A=12.775c - 0.01，R2=0.999 4，表明在测定浓度区间内趋于线性关系。上述结果可用作推导艾叶黄酮提取量。

图1 芦丁标准曲线

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数对艾叶黄酮得率的影响

黄酮类化合物一般易溶于甲醇、乙酸乙酯等溶剂中，其中乙醇毒副作用小，被选为提取溶剂。由图2 可知，随着乙醇体积分数的增加，艾叶黄酮得率呈上升趋势，在乙醇体积分数为80%时，黄酮得率为2.894%。

图2 乙醇体积分数对艾叶总黄酮得率的影响

2.3.2 料液比对艾叶黄酮得率的影响

根据溶解平衡原理，未溶解的黄酮与已溶解的黄酮处于动态平衡状态，当料液比增加的时候，黄酮溶出速度减慢；黄酮进入溶剂的同时，一些其他成分化合物也会浸出，从而起到阻碍作用；随着料液比增加，艾叶黄酮得率总体呈下降趋势。由试验结果得出，艾叶黄酮提取最佳料液比为1∶25（g/mL），得率为2.442%。

2.3.3 超声提取时间对艾叶黄酮得率的影响

艾叶黄酮浓度随着超声提取时间的增加而略微下降，随后缓缓上升，但总体变化不明显。根据结果，50 min 为适宜提取时间。

2.4 正交试验结果及分析

本正交试验的试验指标为提取率。艾叶黄酮的提取率受浸取液乙醇体积分数（A）、料液比（B）、超声提取时间（C）因素的交叉影响[3]。

每个因素下对应水平1 的实验结果的和为K1值，以此类推各个因素对应其余水平的K 值；每个因素下K 值的最大值减最小值为R 值。进行极差分析，范围误差最小的是超声提取时间，范围误差最大的是浸取液乙醇体积分数，说明艾叶黄酮提取率受超声提取时间的影响不显著，而乙醇体积分数对其影响最大，对比以上3 个因素的影响程度主次排列为：提取时间＜料液比＜乙醇体积分数。

2.5 最佳提取条件的验证实验

根据结果可知，黄酮最高得率达到3.53%是在两个变量为80%乙醇体积分数与料液比1∶25 条件下实现的。因此，综合结果来看，用80%乙醇溶液浸取1∶25（g/mL）超声辅助提取50 min，提取率最高。

2.6 艾叶黄酮提取液的抗氧化活性分析

2.6.1 艾叶黄酮提取液的总还原能力

艾叶黄酮吸光度随着提取液浓度升高而整体呈上升趋势，表示艾叶黄酮的总还原能力增强，其抗氧化活性相应加强。样品浓度（x）与吸光度（Y）间的回归方程为Y=3.625 1x+0.253 2，R2=0.990 6。

2.6.2 艾叶黄酮提取液对DPPH·的清除作用

黄酮质量浓度为0.125～0.25 mg/mL 内的区间，DPPH·的清除率随着浓度增加发生急剧上升；而黄酮为0.25 mg/mL 后的浓度区间，清除率随着浓度的增加而趋于平缓增长的趋势，清除率总体呈“S”型增长曲线关系。实验检测得出，最大清除率为96.35%。因此，艾叶黄酮对DPPH·有很好的清除作用。

2.6.3 艾叶黄酮提取液对·OH 的清除作用

如图3 所示，对·OH 的清除率随着提取液浓度上升而升高，整体呈增长趋势。数据显示，对·OH 的清除率在0.5～1 mg/mL 区间质量浓度内急剧上升，随着黄酮提取液浓度增加，黄酮提取液对·OH 的清除率呈正比关系。消除偶然，增加一组质量浓度0.75 mg/mL 的实验，黄酮提取液对·OH 的清除率为90.9%。当黄酮质量浓度为1 mg/mL，黄酮提取液对·OH 的清除率达到97.49%，证明其抗活性氧基团的能力强，抗氧化活性表现明显。

图3 黄酮对·OH 的清除效果

3 结论

由上述试验可知，艾叶黄酮的提取受浸取液浓度、料液比、超声提取时间等因素不同程度的影响。运用正交试验法优化，初步选取艾叶黄酮最佳提取的条件，得到的结果显示，用80%乙醇溶液浸取1∶25（g/mL）料液比浸泡4 h，超声辅助50 min 为最优提取条件。根据抗氧化活性实验可知，艾叶黄酮具有较强的总还原能力和自由基清除活性，在抗氧化方面具有良好的效应，可以作为一种很好的抗氧化剂。国内各领域持续开发利用艾叶的有效成分，证明其有可利用的价值。对艾叶黄酮含量的提取及其抗氧化作用进行的初步研究，能为进一步深入研究提供新思路。