异养硝化-好氧反硝化细菌MF1 的生长及脱氮特性研究

张 咪，刘龙飞，季延滨，牛浩权，刘孝杨，方展明

天津农学院水产学院，天津 300392

高密度和集约化的养殖活动导致了养殖水体中氨氮过度积累[1]。氨氮的大量积累不仅导致水体富营养化和生态环境的破坏，还严重影响水质，危及水生动物的生命安全。研究人员发现了一些异养细菌，它们拥有异养硝化和好氧反硝化的特性，能更快速地处理氨氮，甚至比硝化细菌更为高效[2]。异养硝化-好氧反硝化（HN-AD）细菌是一种同时能在异养条件下进行硝化和在好氧条件下进行反硝化的微生物[3]。在HN-AD 过程中，细菌首先将有机氮或铵盐转化为硝酸盐，然后在好氧条件下将硝酸盐还原为氮气。由于其简化和高效的特性，利用HN-AD 细菌的污水处理技术在设计和操作成本上具有明显优势[4]。为了解决养殖中氨氮去除的问题，寻找本土的HN-AD 细菌变得尤为重要。本文旨在从养殖沉积物中找到这种菌群，优化其处理效果，为其在调控和净化养殖水体中的应用提供实验基础和理论支持。

1 材料与方法

1.1 样本来源

从天津市某对虾养殖池塘中采集底泥样本，放入密封袋中0 ℃运输至天津农学院重点实验室，-80℃冷冻保存，用于分离菌株。

1.2 反硝化细菌MF1 的分离、筛选和鉴定

将底泥样品转移至装有100 mL 无菌LB 液体培养基的锥形瓶中，摇匀以获得均匀的悬浮液，放置于恒温水域摇床上，以25 ℃、100 r/min 的条件培养24 h 后，取0.1 mL 菌液涂布于BTB 固体培养基上，稀释系数范围为8～12 次方。将培养基放入培养箱中至少培养24 h，并根据菌落的状态进行观察[5]。选取目标菌落，对其进行纯化，连续进行3 次，每次间隔24 h。选取经纯化的蓝色或带有蓝色光晕的好氧反硝化细菌菌落[6]，将最终筛选的菌株放入冻存管中与0.25 mol/L 甘油等量混合，即1∶1（V∶V）比例，后将冻存管放入-80 ℃冰箱中进行保存，供下一步分析[7]。

1.3 单因素实验优化培养条件

单因素实验以NH4Cl 为氮源，在不同变量（碳源、温度、C/N 比、转速和pH）下进行。在碳源实验中，丙酮酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、DL-苹果酸被用作唯一碳源[8]。在C/N 比实验中，改变碳源浓度，将C/N 比调整为5、10、15 和20。在温度实验中，温度设置为20 ℃、25 ℃、30 ℃和35 ℃。在pH 实验中，使用0.1 m HCL 或0.1 m NaOH 将初始培养基pH调节至6、7、8 和9。在转速实验中，将转速设置为50、100、150 和200 r/min 来改变DO 浓度。在所有单因素实验中，除变量外的所有其他因素都控制在最佳条件下（丙酮酸钠作为碳源，C/N 比10，pH 7.5，温度27 °C，140 r/min，P/N 比0.26）。样品离心后取上清液测定氨氮（NH4+-N）和总氮（TN）。

1.4 分析方法

用紫外分光光度计（UH5300，HITACHI）在波长600 nm 处测量细菌培养物的吸光度。NH4+-N、NO3--N、NO2--N、TN、PO43--P 的测定采用纳氏试剂光度法、麝香草酚分光光度法、重氮-偶氮光度法、碱性过硫酸钾法、钼锑抗法[9]。不同因素对目的菌株生长影响的实验数据均以平均值±标准差（平均值±SD，n=3）表示，并且使用Origin 2022 软件设计图表。

2 结果与讨论

2.1 菌株MF1 的鉴定

从天津市某对虾养殖池塘底泥中分离出数株可同时具有异养硝化-好氧反硝化能力的菌株。MF1菌株，因其具有最先进的脱氮能力容量，所以被选择用于以下分析。菌株MF1 在琼脂平板上的菌落大小具有以下特点：菌落大小显著，颜色淡黄色，圆形，边缘完整，表面光滑，黏稠状，具有严格的异养特性。采用硅基质吸附柱法从菌体样本中抽提DNA，使用2×Taq Master Mix 对所提取的DNA 进行PCR 扩增，对扩增产物进行一代测序（双向测序）。扩增并测序长度为1 402 bp 的RNA 基因片段，将其提交至GenBank 核苷酸数据库。BLAST 结果表明，菌株MF1 与密歇根克雷伯氏菌亲缘关系较近，相似度高达100%。在此基础上，利用NJ 法（Neighbor-Joining Algorithm）构建系统发育树，进一步鉴定菌株MF1为Klebsiella michiganensis（图1）。

图1 基于菌株MF4 的16S rDNA 基因序列构建的系统发育树

2.2 不同环境因素对菌株MF1 生长及脱氮性能的影响

2.2.1 不同碳源对菌株MF1 生长及脱氮性能的影响

如图2，经过24 h 不间断的培养，丙酮酸钠显著促进菌MF1 的生长，尤其是在第9～12 h 之间，菌株MF1 进入对数生长期，且OD600值开始明显高于其他碳源。同时，氨氮为唯一氮源条件下，培养基添加不同碳源对其总氮降解率及氨氮降解率的影响如图2 所示，丙酮酸钠为碳源时，菌株MF1 对总氮、氨氮的降解率分别为83.68%与84.98%，均显著高于其他三组。

图2 不同碳源对菌株MF1 生长及氨氮、总氮去除效果的影响

2.2.2 最适碳源筛选结果

在对碳源进行筛选的过程中，丙酮酸钠被鉴定为菌MF1 的最适碳源。经过生长曲线监测与脱氮性能的定量分析，菌株MF1 在丙酮酸钠为唯一碳源的条件下展现最为优越的生长性能和代谢活性。总氮、氨氮的去除效率也在丙酮酸钠条件下达到最优。

2.2.3 不同环境因素对菌株MF1 脱氮性能的影响

在最适碳源的条件下，温度对菌株MF1 脱氮性能的影响如图3 所示。当温度为30 ℃时，菌株MF1展现最为优越的生长性能，同时氨氮降解率、总氮降解率最高，分别为95.68%及94.55%。从图3 可以看出C/N 比例为20 时，菌株MF1 的生长性能最优，在C/N 比例为10 时，氨氮降解率、总氮降解率最高，分别为95.69%及94.4%。转速对菌株MF1 脱氮性能的影响，当转速为100 r/min 时，菌株MF1 展现最为优越的生长性能，同时氨氮降解率、总氮降解率最高，分别为95.71%及94.35%。pH 对菌株MF1 脱氮性能的影响，当pH 为7 时，菌株MF1 展现最为优越的生长性能，同时氨氮降解率、总氮降解率最高，分别为95.73%及94.20%。

图3 不同环境因素对菌株MF1 的生长及氨氮、总氮去除效果的影响

2.2.4 菌株MF1 脱氮性能的影响因素

温度30 °C 为菌株MF1 的最佳生长温度，并且在此温度下脱氮性能达到最佳，说明MF1 在适中的温度下活性最高，这可能与其酶活性和细胞代谢的最佳状态有关。菌株MF1 在中性pH 下展现最佳的生长和脱氮性能。这表明MF1 可能是一个中性菌，中性环境有利于其酶的活性和细胞生长。转速为100 r/min 时，菌株MF1 的脱氮性能最佳。C/N 比例为20 时，生长性能最优，为了达到最佳的脱氮性能，需要C/N 比例为10。

3 结论

从某对虾养殖池塘采集的底泥中筛出一株菌株MF1，经16S rDNA 鉴定为Klebsiella michiganensis（密歇根克雷伯氏菌）。各菌株生长至24 h 左右时达到稳定，至24 h 氨氮培养基中菌株MF1 脱氮反应结束，丙酮酸钠对菌株MF1 生长及脱氮性能的促进效果最好。菌株MF1 的脱氮性能与环境因素密切相关。菌株MF1 在温度30 ℃、pH7、转速100 r/min 及C/N 比例为10 的条件下表现最佳的脱氮性能。