香薷挥发油对吴茱萸有效成分透皮吸收的影响

李秋娟,梁亚芳,舒娟,贾聪玲,刘潺潺,2,吴啟南,2,3

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,江苏 南京 210023;3.中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心,江苏 南京 210023)

香薷为唇形科石荠苎属植物石香薷MoslachinensisMaxim.或江香薷Moslachinensis(Jiangxiangru)的干燥地上部分,用于暑湿感冒[1],可药食两用,做药材使用时通称为石香薷。江香薷是石香薷在江西栽培的一个变种,多栽培在江西新余等地区,为江西的道地药材之一[2],产量大,药效好,是目前药材市场上被广泛使用的香薷类商品药材的主流产品之一。香薷挥发油是香薷的主要药效成分,存在于香薷的茎、叶、花部位,气味芳香。麝香草酚、香荆芥酚、对伞花烃和γ-萜烯是香薷挥发油的主要成分[3]。香薷挥发油的药理作用主要集中于抗菌杀菌[4]、增强免疫力[5]等。除此之外,香薷挥发油还可直接外用,在乳液中加入几滴香薷精油,混合均匀后涂抹于脸部,可促进乳液的吸收并达到抗衰老[4]的功效。

近年来外用制剂凭借其给药方式简单、胃肠道刺激小等特点应用日益广泛,且植物挥发油除了自身的药理作用外,还可作为透皮促进剂添加在外用制剂中[6]。与现有的化学促渗剂如氮酮、二甲基亚砜等相比,中药挥发油促进透皮吸收的能力更强,安全性更高,皮肤的刺激性小,还可与被促进药物产生协同作用,发挥更强的治疗效果[7],如唇形科香薷属密花香薷挥发油在浓度为3%时对黄芩苷的促渗效果最佳且优于阳性对照氮酮[8]。中药挥发油对不同性质的成分促渗能力亦不同,比如唇形科薄荷挥发油成分能显著促进亲脂性药物的透皮作用[9],麝香酮能显著增加亲脂性成分阿魏酸、蛇床子素在角质层中的分配系数并促进其透皮吸收[10]。萜类成分是中药挥发油的主要药效成分,也是促进透皮吸收的主要成分,如薄荷醇、薄荷酮、桉叶素等,倍半萜类成分也更易在角质层形成贮存,干扰脂质的萃取[11],通过破坏角质层脂质排列及结构来降低皮肤屏障功能[12]并降低细胞之间的黏附来促进药物透过皮肤[13]。

从古至今,香薷被添加在多种外用制剂中,如除痹泻毒散、香菊兰祛暑洗浴剂等,《中医外治法集要》[14]记录了香薷外用的药方——温胃泥:吴茱萸、橘子叶、香薷、大葱。药捣如泥,烘热,纱布包裹,敷神阙穴,外用暖水袋,每次30～60 min,1日数次,痛止为度,用于治疗寒湿胃痛。方中吴茱萸具有散寒止痛的功效,生物活性成分之一吴茱萸次碱脂溶性、水溶性均较差,口服生物利用度低,透皮吸收亦有角质层向亲水性活性表皮层的渗透障碍[15]。目前的研究仅局限于化学促进剂对吴茱萸成分的促渗[16],因此本研究以吴茱萸中有效成分新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱为指标,考察香薷挥发油对吴茱萸是否具有促渗作用,测定各成分的累积透过量、透皮速率等,考察香薷挥发油作为促渗剂的可能性,通过衰减全反射-傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)扫描、病理切片等方法观察香薷挥发油对皮肤的改变,并通过测定皮内挥发油成分推测香薷挥发油中何种成分产生了促透吸收的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器、药材与试剂

1.1.1 仪器 AUX220万分之一天平(岛津);7890/5975C气相色谱-质谱联用仪(Agilent);DLSB-5L/25低温冷却液循环泵(南京科尔仪器设备有限公司);KQ-300DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);2695高效液相色谱仪配紫外检测器(Waters);TK-12D型透皮扩散试验仪(8 mL立式玻璃扩散池,接口面积3.14 cm2,上海锴凯科技贸易有限公司);SAGA-10TY实验室级超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司);Nicolet iS5-ATR iD红外光谱仪(Thermo Scientific);Tissue-Tek®VIPTM5 Jr全封闭组织脱水机(SAKURA);Tissue-Tek®TECTM5组织包埋机(SAKURA);组织包埋盒(江苏世泰实验器材有限公司);RM2235轮转切片机(LEICA);AXIO SCOPE A1正置式显微镜(ZEISS)。

1.1.2 药材与试剂 香薷Moslachinensis(Jiangxiangru)干燥全草(江西分宜)、吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.干燥果实(江西),经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为正品;无水硫酸钠(批号:150302367D,国药集团化学试剂有限公司);甲醇(批号:22125122,麦克林股份有限公司);乙腈(批号:C14203276,麦克林股份有限公司);甲酸(批号:B1912070,阿拉丁试剂有限公司);乙醇(批号:20221221,国药集团化学试剂有限公司);生理盐水(批号:221010A03,黑龙江齐泰动物保健品有限公司);水合氯醛(批号:Z17D9Y77729,上海源叶生物科技有限公司);PBS缓冲液(批号:20220413,江苏凯基生物技术股份有限公司);氮酮(批号:C14060559,麦克林股份有限公司);E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司);石蜡(批号:20220820,国药集团化学试剂有限公司);咖啡酸(批号:M27GB143417,纯度≥98%)、去氢吴茱萸碱(批号:D22GB172079,纯度≥98%)、吴茱萸次碱(批号:C10J6Y1,纯度≥98%)、吴茱萸碱(批号:J31GB156574,纯度≥98%)、槲皮素(批号:C09S8Y43412,纯度≥98%)、金丝桃苷(批号:Y08N9X74602,纯度≥98%)、绿原酸(批号:Y24J7K16726,纯度≥98%)标准品均购于上海源叶生物科技有限公司;隐绿原酸(批号:JZ22012407,纯度≥98%)、新绿原酸(批号:JZ22040115,纯度≥98%)标准品均购于南京景竹生物科技有限公司;4%多聚甲醛(批号:71051800,Biosharp);二甲苯(批号:20201203,国药集团化学试剂有限公司);苏木素(批号:20230101,武汉皮诺飞生物试剂有限公司);伊红(批号:20230101,武汉皮诺飞生物试剂有限公司)。

1.1.3 动物 SD大鼠,雄性,体质量150～200 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2021-0011。动物饲养于南京中医药大学实验动物中心SPF环境中,湿度40%～70%,温度22～25 ℃,经南京中医药大学实验动物伦理委员会审批,批号:201911A028。

1.2 香薷挥发油制备及GC-MS定性分析

1.2.1 香薷挥发油提取 称取香薷药材80 g,粉碎后加入2 L圆底烧瓶内,加入800 mL蒸馏水,连接挥发油提取器、冷凝管,自冷凝管上端加蒸馏水至溢出挥发油提取器支口,浸泡30 min,加热保持微沸至挥发油体积无明显变化,停止加热。静置片刻,开启测定器下端的活塞,将水缓缓放出,至油层上端到达0刻度线上方5 mm,开启活塞使油层下降,用棕色玻璃瓶收集淡黄色油状液体,冷却,加入适量无水Na2SO4干燥,于低温避光密封保存备用[1]。

1.2.2 GC-MS定性分析香薷挥发油成分 色谱条件:Agilent19091S-433 HP-5ms(30 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度220 ℃;分流比40∶1;程序升温条件:初始温度50 ℃,保持3 min,以3 ℃·min-1升至90 ℃,再以5 ℃·min-1升至150 ℃,继续以10 ℃·min-1升至220 ℃,保持5 min,分析检测时间共计40 min。进样量1 μL。

质谱条件:离子源为EI(70 eV),离子源温度230 ℃,四级杆温度150 ℃,质量扫描范围m/z30～500,溶剂延迟3 min。

1.3 吴茱萸提取物制备及HPLC定量分析

1.3.1 供试品溶液的制备 精密称取干燥的吴茱萸粉末0.6 g,加甲醇30 mL,称定质量,超声提取30 min(功率300 W,频率40 kHz),放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液即得样品溶液[17]。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、金丝桃苷、槲皮素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱标准品适量,用甲醇溶解并定容配制成对照品储备液,精密移取各对照品储备液,加甲醇定容至每1 mL含新绿原酸133.4 μg,隐绿原酸88.0 μg,绿原酸95.2 μg,咖啡酸98.2 μg,金丝桃苷88.4 μg,槲皮素70.0 μg,吴茱萸碱94.8 μg,吴茱萸次碱95.0 μg,去氢吴茱萸碱102.0 μg的混合对照品溶液。

1.3.3 HPLC 色谱条件 Agilent 5 TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm)色谱柱,柱温30 ℃,流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),梯度洗脱(0～15 min,5%～17%A;15～21 min,17%～27%A;21～24 min,27%～48%A;24～35 min,48%～55%A;35～45 min,55%～90%A;45～47 min,90%～5%A),流速1.0 mL·min-1,检测时间50 min,进样量10 μL,检测波长252 nm。

1.3.4 方法学考察 专属性考察:取空白透皮接收液作为空白溶液,取已知浓度的混合对照品溶液作为对照溶液,取经香薷挥发油透皮结束后的接收液作为样品溶液,按已建立的HPLC色谱条件进样。

标准曲线的制作:取混合对照品储备液,稀释为6个不同浓度,按上述色谱条件每个样品重复进样3次,以吸收峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归。

精密度试验:取混合对照品储备液,在1 d内重复进样6针,以各成分平均峰面积计算日内精密度。在3 d内每天测定1次,每次进样3针,以平均峰面积计算日间精密度RSD。

稳定性试验:取混合对照品储备液,分别在室温下放置1、2、4、6、12、24 h,计算峰面积RSD。

加样回收率试验:取已知浓度的透皮接收液1.0 mL,加入各成分含量的80%、100%、120%的对照品,平行5份,计算RSD。

1.4 体外透皮吸收实验

1.4.1 离体鼠皮的制备 取雄性SD大鼠,10%水合氯醛注射麻醉,肥皂水湿润大鼠腹部毛,用刀片将其剔除干净,温水洗净,自然饲养过夜。次日脱颈处死后,立即剥离腹部皮肤,去除皮下脂肪组织与血管,用PBS缓冲液冲洗数次,平铺于滤纸上,-20 ℃冻存备用。实验前将皮肤自然解冻,确保皮肤完整[18]。

1.4.2 供给液的制备 取“1.3.1”项下制备的吴茱萸提取物,透皮实验前加入不同促渗剂,共分为3组,每组3只:①空白组(吴茱萸提取物不加任何促渗剂[17]);②3%香薷挥发油组(每1 mL吴茱萸提取物含30 μL香薷挥发油);③3%氮酮组(每1 mL吴茱萸提取物含30 μL氮酮[11])。超声涡旋使促渗剂均匀分散。

1.4.3 透皮实验 将处理好的大鼠腹部皮肤固定于扩散池的供给池与接收池之间,角质层面向供给池,供给池中加入1.0 mL供给液,接收池中加入8.0 mL 30%的乙醇生理盐水作为接收液[8,18],排出气泡使液面恰与皮肤内层接触,将接收池置于恒温(37±1)℃扩散仪中,加入转子,调节转速(300 r·min-1),分别于搅拌开始后2、4、6、8、10、12 h从样品接收池中抽取0.3 mL接收液,同时补加同温度同体积接收液,样品经过0.22 μm微孔滤膜滤过后HPLC进样分析。并以此按下式计算累积透过量Qn(μg·cm-2)[17],渗透速率常数Js(μg·cm-2·h-1)[18]和增渗倍数ER[10]。

①

②

③

式中V为接收液总体积8 mL,A为有效经皮吸收面积3.14 cm2,Cn为第n个取样点测得的接收液中药物质量浓度,Ci为第i个取样点测得的接收液中药物质量浓度(i≤n-1),Vi为取样体积。J0为不含促渗剂的渗透速率常数。

1.5 香薷挥发油对大鼠皮肤结构的影响

1.5.1 分组与给药 取大鼠腹部皮肤,切成1 cm×2 cm的小片,随机分为空白溶剂组、3%香薷挥发油组、3%氮酮组,制备同“1.3.1”“1.4.2”项下方法,37 ℃水浴24 h[11]。

1.5.2 光镜观察大鼠皮肤结构 将“1.5.1”项下的皮肤取出,4%多聚甲醛固定24 h,常规石蜡切片,进行HE染色、免疫组化染色。

1.5.3 ATR-FTIR扫描分析 将“1.5.1”项下的皮肤取出,用蒸馏水洗净,滤纸擦干,采用ATR-FTIR对大鼠皮肤角质层一侧扫描分析[11]。

1.6 香薷挥发油给药后皮内成分分析

1.6.1 在体皮肤准备 雄性SD大鼠用10%水合氯醛麻醉,刀片剔除腹部体毛,温水洗净,饲养过夜。

1.6.2 皮内成分分析 将大鼠分为空白组及香薷挥发油组,每组3只,每组给药皮肤为3.14 cm2,给药30 min,用棉签除去皮肤表面过量的挥发油后立即脱颈处死,剥离皮肤备用,剪下给药部分皮肤,去除皮下脂肪,将取下的皮肤放入洁净干燥的2 mL离心管中,加入1 mL甲醇溶液,浸泡6 h,收集浸出液,涡旋,12 000 r·min-1,离心10 min,取上清GC-MS分析(方法同“1.2.2”),分析角质层内挥发油成分[19]。

2 结果

2.1 香薷挥发油制备及GC-MS定性分析结果

本实验中提取的香薷挥发油颜色呈淡黄色,提取率为1.25%。挥发油GC-MS测定总离子流图见图1。

图1 香薷挥发油GC-MS图

使用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00软件,采用面积归一化法对各成分色谱峰占总峰面积百分比进行计算,再将获取的香薷挥发油成分的质谱数据,通过NIST14标准质谱图库结合保留指数(RI)鉴定化合物,其中检测出的麝香草酚、香荆芥酚、对伞花烃、γ-萜烯为主要成分,见表1。酚类含氧单萜麝香草酚占比高达76.62%。

表1 香薷挥发油主要化学成分

2.2 HPLC定量分析结果

2.2.1 方法学考察 专属性考察:结果见图2,表明皮肤接收液对实验各成分测定不产生干扰,方法专属性良好。

注:1.新绿原酸;2.绿原酸;3.隐绿原酸;4.咖啡酸;5.金丝桃苷;6.去氢吴茱萸碱;7.槲皮素;8.吴茱萸碱;9.吴茱萸次碱;A.混合对照品;B.吴茱萸提取物;C.空白透皮接收液;D.香薷挥发油组透皮接收液

线性关系考察:以吸收峰面积(A)对质量浓度(C)进行线性回归,得各成分回归方程,结果见表2。

表2 线性关系回归方程

精密度、稳定性、加样回收率考察:结果见表3。各指标成分日内精密度RSD≤1.77%,日间精密度RSD≤2.85%,符合要求,表明仪器精密度良好。各指标成分稳定性RSD≤1.47%,表明在24 h内稳定。

表3 方法学考察结果(%)

2.2.2 吴茱萸提取物定量分析结果 吴茱萸提取物经测定,每1 mL含新绿原酸76.996 5 μg,绿原酸117.641 5 μg,隐绿原酸18.741 7 μg,金丝桃苷19.802 1 μg,去氢吴茱萸碱142.475 5 μg,吴茱萸碱95.999 9 μg,吴茱萸次碱59.191 8 μg。

2.3 体外促渗吴茱萸有效成分的研究分析

对接收液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱各时间点Qn(公式①)进行处理,结果见表4～6、图3。吴茱萸有效成分在不同组别作用下渗透动力学参数结果见表7(运用公式②③)。

表4 空白组累积透过量Q与时间T关系表

表5 香薷挥发油组累积透过量Q与时间T关系表

表6 氮酮组累积透过量Q与时间T关系表

表7 不同组别下吴茱萸中各成分渗透动力学参数

注:A.新绿原酸;B.绿原酸;C.隐绿原酸;D.金丝桃苷;E.去氢吴茱萸碱;F.吴茱萸碱;G.空白组;H.香薷挥发油组;I.氮酮组

由结果可知,香薷挥发油与氮酮对吴茱萸中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱均具有促渗作用,但对吴茱萸碱的累积透过量不如空白组;与香薷挥发油相比,氮酮对大部分成分的累积透过量更大,但香薷挥发油组金丝桃苷、吴茱萸碱的累积透过量比氮酮组大。这表明香薷挥发油对吴茱萸部分成分的促渗作用虽不及氮酮,但与空白组相比,增渗作用仍是较明显的,并且吴茱萸次碱成分只在香薷挥发油组中检测出。

2.4 挥发油对大鼠皮肤结构的影响

2.4.1 光镜观察结果 HE染色结果见图4,与空白组相比,香薷挥发油组、氮酮组角质层有脱落,且部分角质层游离。推测挥发油在一定程度上可以破坏角质层结构,更易药物渗透。免疫组化染色结果见图5,与空白组相比,香薷挥发油组E-cadherin分布较少且分散。

注:a.空白组;b.香薷挥发油组;c.氮酮组;箭头指示外侧角质层变化。

注:a.空白组;b.香薷挥发油组;c.氮酮组;箭头指示上皮细胞层。

2.4.2 ATR-FTIR研究结果 由表8及图6可知,与空白组相比,香薷挥发油组位于2 920 cm-1处的脂质非对称特征峰以及位于2 850 cm-1处的脂质对称特征吸收峰[10]均向高峰位移动,表明香薷挥发油可使皮肤角质层脂质结构发生改变或产生脂质流化,并且可明显看出香薷挥发油组这2个峰位的峰面积要小于空白组,推测香薷挥发油对角质层脂质具有萃取作用[11]。位于1 700～1 500 cm-1的振动Ⅰ峰与Ⅱ峰未向高峰位移动或产生裂缝,表明香薷挥发油可能未改变角质层中角蛋白构象[13]。

表8 大鼠皮肤脂质、酰胺振动峰位移

图6 大鼠皮肤ATR-FTIR图谱

2.5 挥发油给药后皮内成分分析

经透皮后,在大鼠皮内检测出香薷挥发油(图7、表9),且仍以麝香草酚为主,占比59.60%。与透皮前相比,单萜成分蒎烯含量占比明显下降,倍半萜蛇麻烯成分含量占比上升,表明含氧单萜、倍半萜成分[11]可能更易驻留在皮肤内[19]。

表9 皮内挥发油主要成分

图7 挥发油给药后皮内成分分析

3 讨论

皮肤的最外层被称为角质层(SC),由嵌在神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇组成的细胞间脂质基质中的死亡角质细胞组成[20]。透皮吸收促进剂对角质层角蛋白[21]以及脂质[22]成分或结构的改变,有利于增强药物化合物进入皮肤的输送[23],有利于药物的经皮转运。

香薷挥发油中主要成分是酚类单萜麝香草酚,且含氧单萜类是目前挥发油透皮吸收促进剂的主流成分。首先从成分的角度,通过对香薷挥发油给药后皮内成分进行测定,发现倍半萜类成分以及含量占比最高的麝香草酚更易贮存于皮肤,香薷成分中的含氧基团能与皮肤屏障神经酰胺形成氢键以破坏屏障,发挥良好的促渗作用[12];其次从皮肤结构的角度,E-cadherin是一种在上皮细胞(基底层和棘层细胞间)中黏附的表达蛋白,调节细胞与细胞之间的黏附,可维持上皮组织的结构及功能完整性[24],当其低表达时,表明组织细胞黏附作用减弱,角质层通透性增加,药物更易渗透[13]。HE染色及免疫组化染色图亦反映出香薷挥发油可破坏角质层结构,使E-cadherin低表达,因此香薷挥发油是可以作为透皮吸收促进剂进行使用的。

本实验采用体外扩散池法,考察香薷挥发油对吴茱萸中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的促透皮吸收作用。金丝桃苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱这3种成分几乎不溶于水,绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、去氢吴茱萸碱极性中等,可溶于热水。本研究发现香薷挥发油对这几个成分均具有促吸收作用,且对不溶于水的成分吴茱萸碱、金丝桃苷和吴茱萸次碱的促渗作用要优于阳性对照药氮酮。吴茱萸主要的生物活性成分之一吴茱萸次碱只在香薷挥发油组中检出,其水溶性及脂溶性均较差。透皮吸收屏障在于从角质层向亲水性活性表皮层的渗透[25]。通过病理切片观察以及ATR-FTIR扫描分析,验证香薷挥发油可以通过扰乱皮肤角质层的排列[26],提高药物在细胞通道内的渗透性,也进一步说明针对脂溶性及水溶性均较差的成分,可选择促渗效果更显著的香薷挥发油代替氮酮。

综上所述,香薷挥发油对吴茱萸中多种成分具有促渗作用。本文初步了解了香薷挥发油促渗的机制,为香薷挥发油在外用制剂中的应用提供科学依据,将香薷发展成中药外用促渗剂具有良好的前景。