cAMP/CREB信号通路对丙泊酚麻醉致大鼠认知功能损伤、记忆功能的影响及其机制

吴帮林,张伟,朱荣誉,吴述轩,朱贤林

丙泊酚是具有苏醒快、麻醉诱导时间短、起效迅速等优点的常见静脉全身麻醉药物,临床应用较为广泛,但其可能造成患者认知、记忆功能下降,其病程短则数天,长则数月,在严重情况下可伴随终身,对患者身心健康造成了严重影响,但丙泊酚影响认知及记忆功能的具体机制尚未完全明确[1-3]。环腺苷酸/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP/CREB)信号通路可促进神经细胞存活、分化、再生,为细胞内经典传导途径之一,但cAMP/CREB信号通路在丙泊酚麻醉致大鼠认知功能损伤及记忆功能下降的确切作用有待进一步探讨[4-6]。基于此,本研究探索分析了cAMP/CREB信号通路对丙泊酚麻醉致大鼠认知功能损伤、记忆功能的影响及其机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物: 选取SPF级Wistar大鼠30只,月龄5～11个月,体质量210～300 g,购自广州博垚生物科技有限公司,均在湿度40%～60%、室温22～28℃的清洁级动物房中进行适应性喂养5 d,而后进行实验。动物许可证号:SYXK(粤)2023-0318,参照动物实验伦理要求的相关规定进行本实验操作,且经医院伦理委员会批准同意(20210612)。(2)试药试剂 :丙泊酚购自上海抚生实业有限公司(货号S30930-25g),8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)购自艾美捷科技有限公司(货号14431-10),酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购于上海烜雅生物科技有限公司(货号XY2479A),cAMP、CREB 抗体购于深圳市豪地华拓生物科技有限公司(货号PL0403123)。(3)仪器设备: Morris水迷宫购自北京友诚嘉业生物科技有限公司(型号 ACT-200A),光学显微镜购于北京中西华大科技有限公司(型号 SS62-XTL-220),酶标仪购于山东莱恩德智能科技有限公司(型号 LD-96A),PCR仪购自上海凌仪生物科技有限公司(型号 2720)。

1.2 实验方法 2021年12月—2022年2月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院动物实验室进行实验。参照文献[7]方法建立丙泊酚麻醉大鼠模型。 30只大鼠适应性喂养5 d后随机数字表法分为对照组、丙泊酚组、8-Br-cAMP+丙泊酚组各10只。8-Br-cAMP+丙泊酚组大鼠大脑侧室注射cAMP/CREB信号通路激动剂8-Br-cAMP 10 μl,注射10 min后,对丙泊酚组、8-Br-cAMP+丙泊酚组大鼠尾静脉分别注射入丙泊酚10 mg/kg,待翻正反射消失后以丙泊酚24 mg·kg-1·h-1维持麻醉 2 h,以大鼠出现呼吸变慢、角膜反射迟钝、皮肤痛觉消失为建模成功。对照组大鼠肌内注射0.9%氯化钠4 ml/100 g。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 大鼠一般情况观察:于麻醉后第1天对各组大鼠精神、毛发、活动、进食情况进行观察记录。

1.3.2 Morris水迷宫测试:于麻醉后第1天进行Morris水迷宫测试,将高50 cm、直径120 cm、水温25℃的圆形水池分为4个象限,在第1象限设置直径高30 cm、宽10 cm平台,平台、水池内部均为白色,水池四周为形状、颜色不同的视标,为防止大鼠看见水下平台,水中放置钛白粉,实验分为学习阶段5 d、记忆阶段1 d。在学习阶段于每天同一时间在象限中点将大鼠投入水中,摄像头记录大鼠60 s内寻找平台所需时间(逃避潜伏期),若超过60 s则记为60 s,每天进行4次学习,将第5天逃避潜伏期作为最终结果,第6天将平台撤去,将大鼠放入水池任一象限,记录其穿越平台次数。

1.3.3 旷场分析实验:于麻醉后第2天进行旷场分析实验,旷场分析箱为黑色无顶塑料箱(80 cm×80 cm×40 cm),箱底均分为9格,将大鼠置于中央格,进行5 min自由探索,通过图像监视系统对大鼠理毛次数、中央格停留时间、跨格次数(至少3肢跨入邻格)、站立次数(前肢离地>1 cm)进行统计记录,每只大鼠完成测试后场地采用75%乙醇进行擦拭。

1.3.4 病理学观察:于上述实验完成后,将大鼠麻醉后处死,获取大鼠海马组织,制成标本,-80℃保存。海马组织通过梯度酒精脱水、石蜡包埋后将其切薄片,厚5 μm,烘干后脱蜡,采用梯度酒精、蒸馏水行水化及洗涤,之后使用HE染色,于光学显微镜下对大鼠海马组织病理形态变化进行观察。

1.3.5 海马组织氧化应激指标水平检测:取1.3.4中保存待检海马组织,按照试剂盒说明书制作海马组织匀浆,离心留取上清液,通过ELISA法检测各组大鼠海马组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。ELISA 试剂盒由常州贝源鑫生物科技有限公司提供。

1.3.6 海马组织cAMP、CREB mRNA表达量检测:取1.3.4中保存待检海马组织,提取总RNA,以实时荧光定量法鉴定cAMP、CREB mRNA表达量,海马组织中的RNA使用Takara逆转录试剂盒逆转录为cDNA,引物序列采用Primer 5.0软件设计,启动PCR仪。通过2-△△Ct方法计算出cAMP、CREB的mRNA表达量。

1.3.7 海马组织cAMP、CREB蛋白检测:大鼠海马组织中蛋白依照组织蛋白提取试剂盒说明进行萃取,cAMP、CREB表达量通过Western Blot法进行检测,于每孔加入海马组织蛋白80 μg后进行SDS-PDGE电泳,电泳结束后将蛋白电转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭,cAMP、CREB一抗(1∶1 000)于摇床上室温孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后将cAMP、CREB二抗(1∶1 000)于摇床上室温孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次,化学发光显影采用ECL,以GAPDH为内参,相对条带灰度光密度值采用Image J软件分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件包进行

2 结 果

2.1 3组大鼠一般情况观察 对照组大鼠大小便、进食、活动正常,反应灵敏,毛发光亮、颜色正常;丙泊酚组大鼠脱毛明显,毛发无光泽,反应及行动迟缓,精神萎靡;8-Br-cAMP+丙泊酚组大鼠相对活泼好动,毛发光亮,进食正常,脱毛不明显。

2.2 3组大鼠Morris水迷宫测试结果比较 与对照组比较,丙泊酚组大鼠逃避潜伏期时间延长,穿越平台次数下降(P<0.01);与丙泊酚组比较,8-Br-cAMP+丙泊酚组大鼠逃避潜伏期时间缩短,穿越平台次数上升(P<0.01),见表1。

表1 3组大鼠Morris水迷宫测试结果比较Tab.1 Comparison of Morris water maze test results among three groups of rats

2.3 3组大鼠旷场分析比较 与对照组比较,丙泊酚组理毛次数、跨格次数、站立次数下降,中央格停留时间延长(P<0.01);与丙泊酚组比较,8-Br-cAMP+丙泊酚组理毛次数、跨格次数、站立次数上升,中央格停留时间缩短(P<0.01),见表2。

表2 3组大鼠旷场分析比较Tab.2 Comparison of open field analysis among three groups of rats

2.4 3组大鼠海马组织病理学变化比较 对照组大鼠海马区细胞基本无坏死,且分布均匀;丙泊酚组大鼠海马区细胞数量缺失明显且分布散乱,坏死细胞较多;8-Br-cAMP+丙泊酚组大鼠海马区细胞坏死细胞较少,且分布均匀,见图1。

图1 光镜下大鼠海马区组织病理变化对照(HE染色,×200)Fig.1 Comparison of pathological changes in rat hippocampal tissue under light microscopy (HE staining, × 200)

2.5 3组大鼠海马组织氧化应激指标比较 与对照组比较,丙泊酚组MDA水平上升,SOD水平下降(P<0.01);与丙泊酚组比较,8-Br-cAMP+丙泊酚组MDA水平下降,SOD水平上升(P<0.01),见表3。

表3 3组大鼠海马组织氧化应激指标水平比较Tab.3 Comparison of oxidative stress index levels in hippocampal tissue of three groups of rats

2.6 3组大鼠海马组织cAMP、CREB mRNA表达量比较 与对照组比较,丙泊酚组cAMP、CREBmRNA表达量均下降(P<0.01);与丙泊酚组比较,8-Br-cAMP+丙泊酚组cAMP、CREB mRNA表达量均上升(P<0.01),见表4。

表4 3组大鼠cAMP、CREB mRNA表达量比较Tab.4 Comparison of cAMP and CREB mRNA expression levels among three groups of rats

2.7 3组大鼠海马组织cAMP/CREB信号通路相关蛋白相对表达量比较 与对照组比较,丙泊酚组cAMP、CREB蛋白相对表达量均下降 (P<0.01);与丙泊酚组比较,8-Br-cAMP+丙泊酚组cAMP、CREB蛋白相对表达量均上升 (P<0.01),见表5、图2。

图2 3组大鼠海马组织cAMP/CREB信号通路相关蛋白WB图Fig.2 WB diagram of cAMP/CREB signaling pathway related proteins in the hippocampus of three groups of rats

表5 3组大鼠海马组织cAMP/CREB信号通路相关蛋白相对表达量比较Tab.5 Comparison of relative expression levels of cAMP/CREB signaling pathway related proteins in hippocampal tissue of three groups of rats

3 讨 论

丙泊酚是在临床各科手术麻醉中广泛应用的新型静脉麻醉药,但有学者认为,丙泊酚可能造成长时期行为改变,记忆、学习功能异常等[8-9]。本研究通过尾静脉注射丙泊酚模拟临床丙泊酚麻醉过程,发现丙泊酚麻醉可延长逃避潜伏期及中央格停留时间,减少穿越平台、理毛、跨格、站立次数,其结果与既往研究中丙泊酚诱导大鼠认知功能损伤结果相符[10]。

本研究结果显示,8-Br-cAMP+丙泊酚组逃避潜伏期时间短于丙泊酚组,穿越平台次数多于丙泊酚组,中央格停留时间短于丙泊酚组,理毛、跨格、站立次数多于丙泊酚组。水迷宫实验基本原理是利用鼠类本能寻找水中休息场所、先天游泳能力,判断其记忆、学习能力,近年来逐渐应用于大鼠认知功能的评估中[11-13]。旷场分析实验的原理是基于动物活动具有畏惧、趋避空旷场地、探索新环境,可反映出动物面对新环境时的情绪变化、习惯、探究行为,其中理毛、跨格、站立可对动物自身兴奋性、新环境满意程度进行反映,理毛、跨格、站立次数随兴奋性、满意度的提升而增加;中央格停留时间可反映动物认知空间的能力,正常情况下动物可避开空旷环境活动,因此可迅速离开中央格,若其新环境认知能力较差或存在认知功能障碍则可延长其中央格停留时间[14-16]。上述结果均提示激活cAMP/CREB信号通路可改善丙泊酚麻醉造成的大鼠兴奋性、环境适应力下降,提升认知、记忆能力。

有关学者研究发现[17-19],激活cAMP/CREB信号通路可控制阿尔茨海默症造成的认知障碍,且可改善衰老大鼠模型认知能力,其机制可能与清除氧自由基有关。本研究重点在于进一步明确cAMP/CREB信号通路对丙泊酚麻醉致认知功能损伤及记忆功能的影响,结果显示,与对照组比较,丙泊酚组MDA水平上升,SOD水平下降,但8-Br-cAMP+丙泊酚组MDA水平低于丙泊酚组,SOD水平高于丙泊酚组,此外本研究HE染色结果显示丙泊酚组大鼠海马区细胞数量缺失明显且分布散乱,坏死细胞较多,8-Br-cAMP+丙泊酚组大鼠海马区细胞坏死较少,且分布均匀。提示丙泊酚可造成海马组织内氧化应激水平上调,进而引发认知功能损伤及记忆功能下降,而激活cAMP/CREB信号通路可缓解氧化应激损伤,其结果与既往研究结果基本一致。分析其原因为:海马组织是负责储存信息的大脑边缘系统部分,为记忆、学习的关键部位,当遭受氧化应激损伤时可造成海马神经细胞凋亡,从而影响了认知、记忆能力[20-22]。麻醉药品可造成小胶质细胞大量活化,促进氧自由基产生,使得MDA水平上升,SOD水平下降,氧化应激反应加剧[23]。cAMP/CREB信号通路在中枢神经系统中具有重要作用,可参与人类学习、记忆密切相关的神经细胞存活、分化,且可调节氧化应激反应[24]。以上结果均提示cAMP/CREB信号通路可能通过调控氧化应激反应影响丙泊酚麻醉大鼠的认知功能、记忆功能。

综上所述,丙泊酚麻醉后大鼠伴随逃避潜伏期时间、中央格停留时间延长,穿越平台次数、理毛次数、跨格次数、站立次数下降等表现,经cAMP/CREB信号通路激动剂8-溴-环腺苷酸干预后可改善上述情况,其机制可能与调节海马组织氧化应激反应有关。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

吴帮林:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;张伟:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;朱荣誉:提出研究思路,分析试验数据;吴述轩:课题设计,论文审核;朱贤林:进行统计学分析,论文审核