结直肠癌组织中SPON2、MGP表达及临床意义

杨同昕,董建宁,施雪松,曹红勇,杨维军

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤,全球每年新发患者190万,死亡93.5万[1]。CRC的治疗包括手术、化疗等,但肿瘤复发及转移率较高,患者生存预后较差[2]。脊椎蛋白2(Spondin 2,SPON2)属于细胞基质蛋白Spondin家族成员,能通过整合素家族识别病原体,参与先天免疫和适应性免疫过程[3]。研究发现,SPON2在肝癌、胰腺癌等恶性肿瘤中表达上调[4-5],介导肿瘤细胞与基质间的相互作用,促进肿瘤侵袭和转移。基质Gla蛋白(matrix Gla protein,MGP)是一种分泌型蛋白,参与调节骨骼钙磷代谢、动脉粥样硬化等生物学过程[6]。近年来发现,MGP在胃癌、乳腺癌等肿瘤中过度表达,其通过与细胞外基质结合,促进肿瘤细胞的侵袭和增殖,是潜在的肿瘤标志物[7]。目前CRC中SPON2、MGP表达的临床意义尚不清楚,本研究通过检测CRC中SPON2、MGP的表达,分析两者与临床病理特征及预后的关系,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018年1月—2020年1月南京市第一医院普外科收治行手术治疗CRC患者94例,男51例,女43例,年龄26～79(64.47±9.79)岁;肿瘤位置:直肠42例,结肠52例;淋巴结转移33例;肿瘤直径≤5 cm者55例,>5 cm者39例;肿瘤TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期61例,Ⅲ期33例;肿瘤分化程度:高中分化59例,低分化35例。本研究经医院伦理委员会审核通过,患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①经术后病理组织学检查确诊为CRC;②均为原发初诊患者;③临床资料完整。(2)排除标准:①年龄<18岁或>80岁;②术前新辅助放化疗或靶向治疗;③复发性CRC、遗传性CRC或合并其他恶性肿瘤;④合并其他严重脏器功能衰竭;⑤合并肺炎、泌尿系统感染等感染性疾病。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 SPON2、MGP蛋白表达检测:留取术中获取的部分CRC癌和癌旁组织(距离癌组织边缘>5 cm)各约100 mg。将CRC癌和癌旁组织常规10%福尔马林固定12 h,常规石蜡包埋后切片(切片机购自德国Leica公司,型号 RM2125 RTS),厚度4 μm,62℃烤片2 h后进行免疫组化染色(试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司,货号PV-9004)。二甲苯透明化及石蜡包埋, 切片层厚4 μm,62℃烤片2 h后,梯度乙醇水化,在100℃柠檬酸溶液中抗原热修复10 min,加入一抗(兔抗人SPON2、MGP单克隆抗体,1∶200,购自美国abcam公司,货号ab215451,ab273651),4℃过夜,加入二抗(HRP结合的羊抗兔抗体)37℃下孵育1 h,DAB显色5 min,苏木精复染后,盐酸酒精分化,梯度乙醇脱水后中性树胶密封。由2位病理科医生在200倍显微镜(日本奥林巴斯公司,型号CX31)下阅片, SPON2、MGP蛋白阳性染色为细胞核和/或细胞质出现棕黄色染色。采用半定量方法,根据染色强度和阳性细胞百分比的乘积计算最终得分。染色强度评分:0分为无染色;1分为淡黄色染色;2分为棕黄色染色;3分为棕褐色染色。阳性细胞百分比评分:0分为≤5%;1分为6%～25%;2分为26%～50%;3分为51%～75%;4分为≥76%。最终评分>2分为阳性,≤2分为阴性。

1.3.2 随访情况:自CRC患者出院时开始随访,随访3年,第1年每3个月随访1次,第2～3年每6个月随访1次,随访终点时间为2023年1月。随访内容为病史、体格检查、腹盆腔超声或CT等,记录患者生存情况、生存时间等。

1.4 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件分析数据。计数资料以频数或率(%)表示,组间比较采用卡方检验。绘制Kaplan-Meier生存曲线,Log-Rank法比较不同SPON2、MGP表达生存曲线的差异。CRC预后影响因素分析采用多因素Cox比例风险模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRC癌及癌旁组织中SPON2、MGP蛋白表达的差异比较 SPON2、MGP蛋白在CRC癌组织细胞核和细胞质中均有表达,部分表达于细胞核。CRC癌及癌旁组织中SPON2阳性率分别为65.96%(62/94)和6.38%(6/94)。CRC癌及癌旁组织中MGP阳性率分别为63.83%(60/94)和8.51%(8/94)。SPON2、MGP蛋白在CRC癌组织中的阳性率高于癌旁组织,差异具有统计学意义(χ2=72.251、62.298,P均<0.001)。

图1 SPON2、MGP蛋白在CRC癌及癌旁组织中的表达差异(免疫组化染色,×200)Fig.1 Differential expression of SPON2 and MGP proteins in CRC cancer and adjacent tissues (immunohistochemical staining, × 200)

2.2 SPON2、MGP表达在CRC不同临床病理特征患者中比较 低分化程度、TNM分期Ⅲ期及有淋巴结转移患者SPON2、MGP阳性率分别高于高中分化、TNM分期I～Ⅱ期及无淋巴结转移患者,差异均有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 SPON2、MGP蛋白表达在CRC患者不同临床病理特征中比较[例(%)]Tab.1 Comparison of SPON2 and MGP protein expression in different clinical and pathological characteristics of CRC patients

2.3 SPON2、MGP蛋白表达与CRC患者预后的关系 CRC患者随访中死亡32例,失访2例,3年生存率为65.22%(60/92)。SPON2阳性组、阴性组3年生存率分别为54.84%(34/62)和86.67%(26/30);MGP阳性组、阴性组3年生存率分别为53.33%(32/60)和87.50%(28/32)。SPON2阳性组、MGP阳性组3年累积生存率低于SPON2阴性组、MGP阴性组,差异具有统计学意义(χ2/P=8.966/0.003、12.420/<0.001),见图2。

图2 Kaplan-Meier曲线分析SPON2、MGP蛋白表达与CRC患者预后的关系Fig.2 Kaplan Meier curve analysis of the relationship between SPON2, MGP protein expression and prognosis in CRC patients

2.4 CRC患者预后的多因素Cox回归分析 以CRC患者预后为因变量,以上述结果中P<0.05项目为自变量进行多因素Cox回归分析,结果显示:肿瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、伴淋巴结转移、SPON2阳性、MGP阳性是影响CRC患者预后的独立危险因素,见表2。

表2 CRC患者预后的多因素Cox回归分析Tab.2 Multivariate Cox regression analysis of prognosis in CRC patients

3 讨 论

CRC是我国常见的消化系统恶性肿瘤,男性常见,随着人们生活水平及饮食方式的改变,其发病率有不断升高的趋势[8]。目前CRC的治疗以手术辅以放化疗的综合治疗为主,但术后仍有许多患者出现复发转移,导致不良预后。目前肿瘤TNM分期是临床中评估CRC患者预后的主要依据,但CRC具有高度异质性的特点,即使相同分期、相同治疗方案的CRC患者,疾病进展存在较大差距,许多患者不能获益[9]。深入研究CRC疾病机制,寻找能够有效评估预后的肿瘤标志物,对于CRC的个体化治疗,具有重要意义。

SPON2编码基因位于4p16.3,包含TSR结构域和FS结构域,能够作为模式识别受体结合细菌脂多糖、整合素等识别病原体,启动内源性免疫反应。研究表明,肺癌中SPON2的表达能激活核因子κB信号通路,上调基质金属蛋白酶2和9的表达,促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[10]。本研究中,CRC癌组织中SPON2表达上调,提示SPON2可能与CRC的肿瘤发生有关。CRC中SPON2的表达受结肠癌转移相关基因1的表达调控。研究表明,结肠癌组织中结肠癌转移相关基因1的表达异常升高,其能与SPON2基因启动子结合,促进SPON2蛋白的过度表达,增强CRC肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力[11]。本研究中,CRC中SPON2表达与不良临床病理特征有关,提示SPON2参与促进CRC肿瘤的恶性进展。分析其原因,CRC中SPON2能够激活整合素β1/富含脯氨酸的酪氨酸蛋白激酶2,促进单核细胞的细胞骨架重塑和跨内皮迁移,并通过上调肿瘤细胞中CC趋化因子配体2的表达,诱导巨噬细胞向M2型极化,促进肿瘤免疫逃逸,导致肿瘤过度增殖和侵袭[12]。另外,SPON2表达升高还能够诱导血管内皮生长因子A和C的表达,促进胶质瘤等恶性肿瘤的肿瘤血管新生及淋巴管生成,导致肿瘤细胞发生血行转移和淋巴转移[13]。本研究中,CRC组织中SPON2阳性表达的患者生存预后较差,提示SPON2是新的CRC预后评估的肿瘤标志物。分析其原因,SPON2阳性的CRC肿瘤细胞恶性程度高,肿瘤的增殖、侵袭及转移能力强,肿瘤术后复发和转移风险高,导致患者预后较差。有学者利用高亲和力SPON2肽配体竞争性结合靶向SPON2的SH结构域保守残基,降低SPON2的生物学活性,结果胃癌肿瘤细胞的增殖及侵袭能力明显受到抑制,实验动物的生存率也显著增加[14]。因此,SPON2的表达促进肿瘤发生发展,是新的CRC预后评估肿瘤标志物,以SPON2为靶点是潜在的CRC治疗方案,值得临床深入研究。

MGP是人体内血管和软骨钙化的抑制因子,广泛表达于骨、心脏及肺脏等人体组织中,参与骨组织代谢和异位钙化。近年来发现,MGP mRNA在乳腺癌、肾癌、肝癌和卵巢癌中均异常表达上调,可能是新的肿瘤早期诊断及预后评估的肿瘤标志物[7, 15]。本研究中,CRC癌组织中MGP表达上调,提示MGP可能参与CRC的肿瘤发生。CRC中MGP的表达上调与Wnt通路的激活有关。研究表明,CRC中存在Wnt/β-连环蛋白通路过度激活的现象,β-连环蛋白活化后进入细胞核并在转录水平直接上调MGP的表达,促进肿瘤细胞上皮间质转化及肿瘤细胞干性特征形成,增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[16-17]。本研究中,MGP表达与CRC不良临床病理特征有关,提示MGP促进CRC的肿瘤进展。研究发现,CRC中MGP的表达升高能够磷酸化激活核因子κB,上调肿瘤细胞表面程序性死亡因子配体1的表达,其能结合CRC肿瘤微环境中CD8+T细胞表面的程序性死亡因子1,促进CD8+T细胞耗竭及免疫效应能力的降低,导致肿瘤免疫逃逸及肿瘤进展[18]。另有研究报道,CRC肿瘤细胞中MGP的表达上调能够显著增加细胞内游离Ca2+浓度,促进p65磷酸化,进而上调癌基因c-MYC、细胞间黏附分子1和血管内皮生长因子A的表达,增强肿瘤细胞的恶性增殖和转移能力[19]。本研究中,CRC癌组织中MGP阳性是CRC患者不良生存预后独立危险因素,提示检测CRC癌组织中MGP的表达有助于评估CRC患者的生存预后。分析其原因,一方面是MGP阳性表达的CRC肿瘤细胞恶性程度高,肿瘤转移能力较强,术中难以彻底切除,术中残留的微小病灶均能增加术后肿瘤复发转移的风险。另一方面,MGP的表达能够增强CRC肿瘤细胞对放化疗等治疗的抵抗性,降低术后辅助治疗疗效。有研究发现,CRC中MGP的过表达能够通过上调铜转运蛋白1,下调P型铜转运ATP酶,提高肿瘤细胞对奥沙利铂的耐药性,而体外细胞实验中敲除MGP的表达能够显著增加CRC肿瘤细胞系对奥沙利铂的敏感性[20]。因此,MGP参与CRC肿瘤的发生发展,是新的评估CRC预后的肿瘤标志物。

综上所述,CRC中SPON2、MGP表达升高,两者与CRC患者的TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关,均参与CRC的肿瘤进展过程。肿瘤TNM分期Ⅲ期、低分化程度、伴淋巴结转移、SPON2阳性、MGP阳性是影响CRC患者预后的独立危险因素。临床医师可根据CRC癌组织中SPON2、MGP的表达,同时结合传统TNM分期、肿瘤分化程度等临床病理特征,对CRC患者生存预后进行评估,指导临床诊治。本研究也存在不足,为单中心回顾性研究,样本量有限,有待今后设计前瞻性多中心大样本临床试验,深入研究SPON2、MGP的临床价值。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨同昕:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;董建宁:提出研究思路,分析试验数据,论文审核;施雪松:实施研究过程,资料搜集整理,论文修改;曹红勇:进行统计学分析;杨维军:课题设计,论文撰写