microRNA-145对癫痫细胞炎症反应的影响

樊丽霞 蒋小玲

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，其特征性表现为癫痫发作，发作形式多种多样，可表现为短暂性运动、感觉、意识和自主神经等功能障碍，最明显的发作形式为强直-阵挛发作。癫痫发作给患者生理方面造成极大痛苦，并因病耻感影响其生理方面。目前治疗癫痫的目的是抑制神经元的异常放电，以控制癫痫发作的起始和进展。目前抗癫痫发作药物已被广泛应用，且抗癫痫发作药物已更新至第3 代，但约1/3 的患者仍发展为难治性癫痫，这意味着当前的药物未能控制这些患者的癫痫发作，部分患者可以进行各种手术治疗，但一些患者的术后结果仍不理想[1-3]。就目前的情况而言，有必要探索癫痫发生的新机制，开发新的治疗靶点。尽管癫痫的细胞和分子机制尚不完全清楚，但近年来，越来越多的证据表明，炎症在癫痫发病机制中起着重要作用，且抗炎可以减少癫痫发作[4-5]。miR 是一类内源性的非编码小分子RNA，主要通过与靶mRNA 的相互作用对特定基因表达进行负调控，导致其降解或抑制其翻译，从而导致细胞中的蛋白质水平总体较低；近年来，miRNA 在癫痫发病机制中的作用是一个快速扩展的研究领域[6]。据报道已观察到miRNA-134、miRNA-181a 和miRNA-146a 等在癫痫患者中的改变[7]。miR-145 可参与多种疾病的发生发展，研究发现骨髓间充质干细胞通过miR-145 抑制缺氧条件下A549 肺癌细胞的恶性行为，miR-145 通过直接靶向成纤维细胞中的SOX9 通过AKT/GSK-3β/β-连环蛋白信号通路减轻心脏纤维化[8-9]。但目前有关miR-145 在癫痫中研究报道较少，尤其在癫痫炎症反应中的影响鲜有报道。本研究通过体外建立癫痫细胞模型，旨在探讨miR-145 对癫痫细胞炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

CTX-TNA 星形胶质细胞购自LMAI Bio 公司；高糖达尔伯克改良伊格尔（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）培养基购自Hyclone、OPTI-MEM 培养液、胎牛血清购自GIBCO 公司；Lipo2000 购自Invitrogen 公司；Trizol试剂、miR-145 模拟物（miR-145 mimics）、miR-145 抑制剂（miR-145 inhibitor）、cDNA 反转录试剂盒购自赛默飞科技有限公司；CCK8 试剂盒购自abcam 公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、青霉素链霉素（双抗）购自北京索莱宝科技有限公司；Dual-Luciferase 报告基因检测系统检测试剂盒购自Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及癫痫细胞模型建立

CTX-TNA2 细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培养液（含D-葡萄糖4.5 g/L、碳酸氢钠3.4 g/L、L-谷氨酰胺584 mg/L、青霉素75 mg/L、链霉素100 mg/L），为了建立癫痫样活性，将细胞置于37℃，含有5%CO2的CO2孵育箱中，在95%湿度条件下培养，并用10 ng 白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）持续处理24 h。

1.2.2 分组

将经IL-1β 处理过的CTX-TNA2 细胞接种于6 孔板中，共3 个复孔，每孔加入2 mL 的细胞悬液。细胞随机分 为5 组：NC 组、inhibitor NC 组、miR-145 inhibitor 组、mimics NC 组、miR-145 mimics 组。用miR-145inhibitor 沉默了miR-145，而用miR-145 mimics 在CTX-TNA 细胞中过表达dmiR-145。用150 μL 基本培养基稀释Lipo2000，温和混匀并于37 ℃孵育5 min，用150 μL 基本培养液分别稀释10 μL miR-145 mimics、无义序列mimics、无义序列inhibitor、miR-145 inhibitor，温和混匀，随后在室温下孵育20 min，将混合液加入各孔中，置于37 ℃、含有5%CO2、常规湿度的培养箱中培养48 h。

1.2.3 CCK8 检测细胞活性

将CTX-TNA 细胞（4×103个细胞/孔）铺在96 孔板中生长24 h。除去培养基，并将CCK-8 溶液加入培养基中，使用酶标仪在490 nm 处测量光密度（optical density，OD）值，OD 值越大，细胞活力越强。

1.2.4 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）实验

收集各组细胞上清液，检测细胞上清液中炎症因子白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，操作按照ELISA 试剂盒说明书进行。绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.2.5 定量即时聚合酶链锁反应（quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR）

使用Trizol 试剂从NC 组以及其他实验组细胞中分离总RNA。通过使用cDNA 反转录试剂盒对总RNA 进行反转录后获得cDNA。RT-qPCR 在7900HT Fast Real-Time PCR System 上操作，实时聚合酶链锁反应（polymerase chain reaction，PCR）系统测量炎症细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α 的表达水平，以GAPDH 内参，引物序列见表1。各组mRNA 的相对表达量通过2-ΔΔCt进行分析。

表1 RT-qPCR 引物列表

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析。计量资料以（）表示，多组间比较采用One-Way ANONA 分析和多重分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α 的mRNA和蛋白表达

与NC 组、miR-145 mimics 组比较，miR-145 inhibitor组IL-2、IL-6、TNF-α mRNA、蛋白水平均降低（P＜0.01）；与NC 组、miR-145 inhibitor 组比较，miR-145 mimics 组蛋白、mRNA 水平均升高（P＜0.01）。见图1、表2。

图1 各组炎症因子mRNA 的相对表达。①与NC 组比较，③与miR-145inhibitor 组比较，⑤与miR-145 mimics 组比较，P ＜0.001。

表2 各组炎症因子的蛋白表达（n ＝3，）

表2 各组炎症因子的蛋白表达（n ＝3，）

注：①与NC 组比较，②与inhibitor NC 组比较，③与miR-145 inhibitor 组比较，④与mimics NC 组比较，⑤与miR-145 mimics 组比较，P ＜0.001。

2.2 各组细胞活力检测结果

在12、24、48 h，与NC 组、miR-145 inhibitor 组比较，miR-145 mimics 组细胞活力均下降（P＜0.01）；与NC 组、miR-145 mimics 组比较，miR-145 inhibitor 组细胞活力均升高（P＜0.01）。见图2、表3。

图2 各组细胞活力。①与NC 组比较，③与miR-145 inhibitor 组比较，⑤与miR-145 mimics 组比较，P ＜0.001。

表3 各组细胞活力（n ＝3，）

表3 各组细胞活力（n ＝3，）

注：①与NC 组比较，②与inhibitor NC 组比较，③与miR-145 inhibitor 组比较，④与mimics NC 组比较，⑤与miR-145 mimics 组比较，P ＜0.001。

3 讨论

癫痫一直是位列世界卫生组织（World Health Organization，WHO）重点防治的五大神经精神疾病之一，据WHO 2018 年发布的实况报道，全世界目前有约5 000 万的癫痫患者，据估计我国有高达1 000 万以上的人群受累，同时每年有60 万左右新发癫痫患者，年经济负担超过200 亿人民币。癫痫的病因包括基因突变、急性脑损伤（如中风、创伤、脑肿瘤或癫痫）、中枢神经系统（central nervous system，CNS）感染、自身免疫性疾病和代谢紊乱[10]。然而，对于许多患者来说，癫痫的病因尚不清楚。此外，癫痫最常与神经系统并发症相关，即认知功能障碍、抑郁和焦虑以及精神疾病，包括孤独症谱系障碍，严重影响患者的生活质量。但当前的药物未能控制大约1/3 的患者，并发展为难治性癫痫[1]。近年来，在癫痫发病机制方面取得了一些进展，包括形态学改变、转录组调控、表观调控和分子信号通路，但由于癫痫的复杂性，其发病机制仍不十分清楚，这是癫痫极难治愈的主要原因[11]。因此，对癫痫发生机制的深入认识，对开发新的癫痫治疗方法具有重要意义。

越来越多的证据表明，炎症在癫痫发病机制中起着重要作用，癫痫发生与脑组织中升高的、严重的和慢性的炎症状况有关，伴随着神经元损伤和胶质增生[2-3]。炎症反应失调可能导致神经连接异常和神经网络兴奋过度，促进癫痫的发生和发展，癫痫活动期间脑细胞分泌的炎症介质，如细胞因子、趋化因子和前列腺素，不仅会促进炎症，而且会作为神经调节剂影响神经元功能[10]。炎症因子可影响神经元和神经胶质细胞的电活动细胞，除了引起局部炎症反应，同时癫痫发作也会引起神经炎症反应，进一步加重神经细胞损伤，从而形成恶性循环，通过不同途径抑制炎症小体复合物成分的特异性抑制剂，或其他天然和化学药物可改善癫痫症状。研究表明，IL-1β 及TNF-α 等与癫痫有关，IL-1β 的表达与癫痫的严重程度相关[12]。IL-1β由多种细胞产生和分泌，在癫痫持续状态的急性期和自发癫痫发作的慢性期，IL-1β 在活化的小胶质细胞和星形胶质细胞中被强烈诱导，主要由星形胶质细胞维持。有研究发现，IL-1β 能促进癫痫发生[13]。IL-2 可促进神经及胶质细胞生长的作用，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）具有促进细胞增殖和分化的作用，国内有学者推测，IL-2、TNF-α 可能参与了所有癫痫类型的发生与发展[14]。然而，癫痫的炎症调控机制尚不完全清楚。

许多研究提示星形胶质细胞功能障碍促进癫痫的发展和进展，星形胶质细胞在癫痫的发病机制中起着关键作用[15]。由于新生大鼠皮层提供了丰富的星形胶质细胞，CTX-TNA2 细胞已被用于建立癫痫的细胞模型[16]。虽然原代星形胶质细胞可能是一个更好的选择，但因其很难分离和培养，且需要对其进行鉴定；一致性不如足够好的细胞系；细胞寿命有限，很难转染[17]。因此，选择CTX-TNA2 细胞作为本研究的模型。此外，IL-1β 诱导的炎症是癫痫发病的一个关键因素。基于这些证据，本研究认为用IL-1β 处理的CTX-TNA2 细胞可以作为研究癫痫的体外模型。

众所周知，miRNA 可通过与靶基因的特定序列互补，在转录后水平调节靶基因的表达，并参与一些生命过程，如生物生长发育、细胞增殖分化、致癌、凋亡和脂质代谢能够，调节多种疾病的信号通路，目前发现已成为癫痫病因和发展的关键因素[18]。有研究发现，下调miR-145 通过调节海马神经元凋亡提高癫痫大鼠学习记忆能力[19-22]。本研究证明了在IL-1β 处理的CTX-TNA2 癫痫细胞模型中，抑制miR-145 可降低IL-2、IL-6、TNF-α 的mRNA 及蛋白表达，提高了癫痫细胞的生存能力。

miRNA-145 对炎症反应的影响有助于阐明癫痫的发病机制。在这项研究中，证明抑制miR-145 抑制癫痫的炎症反应、提高了癫痫细胞的生存能力，但其上下游的调控机制有待进一步研究。本研究中的所有数据均来自体外试验，但计划将在体内进行进一步的研究，以验证癫痫的调节机制，为癫痫患者的治疗策略提供新的靶点。

综上所述，癫痫是神经系统常见疾病之一，癫痫发作严重影响患者的身心健康，目前有1/3 患者为药物难治性癫痫，因此开发新的治疗靶点至关重要。但因癫痫的复杂性，癫痫病因机制目前尚未完全清楚，越来越多的研究已经证实炎症在癫痫的发病机制中起着重要作用，促进癫痫的发生与发展，且与癫痫互为因果，本研究证实，在体外实验中抑制miR-145 抑制癫痫的炎症反应，可能为癫痫治疗提供新的方向。