乳酸菌发酵饼干的品质特性

胡莉萍， 孙 锋， 张均叶， 朱 松， 李 玥*

（1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 亿滋食品企业管理（上海）有限公司，江苏 苏州 215126）

发酵饼干（fermented cracker）是以小麦粉、水为主要原料，加入酵母或（和）乳酸菌，再加入其他辅料，经过拌粉、成型、烘烤等操作工艺加工制作而成的产品[1]。 有学者研究表明，经酵母发酵后可以提高饼干的淀粉消化性，有利于人体对淀粉等物质的消化吸收[2]。 此外，闫博文等的研究发现复合乳酸菌和酵母共同发酵会明显提高饼干的功能营养特性，同时能赋予面制品独特的风味[3]。 Chang 等研究表明，发酵面团在不同发酵时间段有不同的挥发性风味物质，且发酵面团中风味物质含量和种类明显高于未发酵面团[4]。 有学者通过研究乳酸菌发酵产品的品质特性得出，发酵后馒头的硬度有所降低、体积有所增加，风味品质的评价结果明显高于未加乳酸菌发酵馒头[5]。

蛋白质作为食品体系中的大分子物质之一，与人们日常的膳食息息相关。 随着人们生活水平的提高，大家日益关注食品的品质和营养特性[6]。 食物中蛋白质的质和量、蛋白质体外消化率的高低、各种氨基酸的组成与比例等都与人体的健康息息相关，蛋白质指标的评价对于高品质健康食物的研究与开发具有重要的指导意义[7]。Xing 等研究发现，乳酸菌和酵母在面团中共同作用不仅可以促进菌株之间的代谢，提高乳酸菌的产酸和酵母的产气能力，而且乳酸菌在发酵过程中会逐渐降低面制品的pH，进而提高面粉中菌株自身的蛋白酶活性，促进大分子蛋白质的降解[8]。 因此，乳酸菌发酵对终产品的蛋白质体外消化率、氨基酸组成及质构和风味的影响值得深入研究。

作者分别采用两株乳酸菌制备发酵饼干，以市售梳打饼干和酵母单独发酵饼干作为对照，探究乳酸菌发酵饼干的蛋白质消化性，分析不同发酵饼干中蛋白质营养指标以及饼干品质特性的变化情况，为开发高品质饼干产品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酵母、小麦粉、全麦粉、起酥油、盐、膨松剂、奶粉：亿滋食品企业管理（上海）有限公司；市售梳打饼干：欧尚超市；DN-1（植物乳杆菌）乳酸菌粉：丹尼斯克公司；JN-1（副干酪乳杆菌）：中国中西部重庆市沙坪坝区的泡菜中分离得到； 胰酶 （P7545，8×USP）、胃蛋白酶（P7000，≥2.5×105U/g）：美国Sigma公司；盐酸、硫酸、三氯乙酸（TCA）、硫酸铜、氢氧化钠（粒状）、氯化钙、硫酸钾：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

ARM-01 型全齿轮传动搅拌机： 福建德霸食品机械有限公司；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器： 巩义市俞华仪器有限公司；TD6 型低速离心机： 湖南赫西仪器装备有限公司；EL20 型pH 计、AL204 型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TA-XT2i 型物性测试仪：英国Stable Micro Systems 公司；焙烤设备（打孔板）：亿滋食品企业管理（上海）有限公司特殊定制；KDN-103F 型凯氏定氮仪：上海纤检有限公司；GC-2010PLUS 型气相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵饼干的制备发酵饼干的配方如表1所示。 按照表中的制作配方，将酸面团所需各原料按照其比例称量好，其中，预先将酵母或者乳酸菌放在温水中融化，起酥油融化至液态。

表1 发酵饼干的配方表Table 1 Recipe of fermented crackers

乳酸菌发酵饼干的制作步骤：将小麦粉、奶粉、酵母、乳酸菌、无菌水一起加入到ARM-01 型全齿轮传动搅拌机中，在一定速度下搅拌4 min，待搅拌机停止后，将搅拌机及搅拌缸上黏着的面团用刮板刮下，将搅拌完成的发酵面团置于35 ℃、相对湿度80%的发酵箱中发酵19 h。发酵结束后，将发酵好的酸面团和剩余小麦粉、全麦粉、起酥油、膨松剂、盐一起放入搅拌机中，搅拌混合4 min，在温度30 ℃、相对湿度80%下继续发酵4 h，得到主面团。 待主面团发酵结束后，用压片机反复压至最终厚度为1 mm，用模具分割成5 cm×5 cm 的面片，之后放在上火250 ℃、 下火250 ℃的焙烤箱中烘烤6 min，冷却后得到发酵饼干的成品（两种乳酸菌发酵饼干分别称为DN-1 饼干、 JN-1 饼干）。

酵母单独发酵饼干的制作步骤同乳酸菌发酵饼干，但配方略有不同。 其中，酸面团配方中不加乳酸菌，主面团配方中膨松剂的质量为4.5 g（酵母单独发酵饼干称为Control 饼干）。

1.3.2 发酵饼干蛋白质体外消化率的测定总蛋白质质量的测定参考《食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）进行[9]。

蛋白质体外消化率的测定参照Minekus 等建立的静态体外消化模拟方法[10]，并略有改动。 将1.000 g的固体样品放在带盖的样品瓶中，并加入转子和4 mL去离子水， 在37 ℃的恒温水浴锅中保温3 min 后，将5 mL 的混合好的液体样品与4 mL 模拟胃液流体（SGF）混合，其中SGF 中包含3 mL 胃蛋白酶溶液 （质量浓度为7 mg/mL， 酶活力2.5×105U/g）、0.25 μL 0.3 mol/L 的氯化钙溶液，再用1 mol/L 的盐酸调节pH 至3.0。将混合后的样品补加水至总体积10 mL，在37 ℃恒温水浴锅中混合2 h 并不断搅拌，在胃消化阶段120 min 时间点取样后，沸水浴灭酶。之后， 将10 mL 混合好的液体样品与8 mL 的模拟肠液流体（SIF）混合，其中SIF 中包含2 mL 胰酶溶液 （质量浓度为8 mg/mL， 酶活力8×USP）、20 μL 0.3 mol/L 的氯化钙溶液， 再用1 mol/L 的NaOH 溶液调节pH 至7.0。将混合后的样品补加去离子水至总体积20 mL，在37 ℃恒温水浴锅中混合2 h 并不断搅拌，在肠消化阶段120 min 时间点取样后，沸水浴灭酶。 将取出后的胃消化液和肠消化液样品，加入等体积的三氯乙酸 （TCA） 溶液 （体积分数为30%）， 静置至室温， 在4 500 r/min 下离心20 min后弃去上清液，用凯氏定氮法测定沉淀中未被降解的大分子蛋白质质量。 蛋白质体外消化率为特定时间点生成的游离氨基酸和小分子可溶性蛋白质的质量与原饼干样品中总蛋白质质量的比值， 按照下式（1）计算。

式中：DP为发酵饼干的蛋白质体外消化率，%；mT为发酵饼干样品总蛋白质质量，mg；mC为发酵饼干样品在胃肠消化阶段未被消化的蛋白质质量，mg。

1.3.3 蛋白质组分的营养指标估算参照文献[11]中的方法，对酸水解后饼干样品中的氨基酸进行蛋白质组分营养指标估算。 主要有：必需氨基酸质量分数（EAA）、必需氨基酸与总氨基酸的质量比（E/T）、氨基酸评分（AAS，指被测样品蛋白质中氨基酸含量与参考样品蛋白质中氨基酸含量之比）、 生物价（BV，指测试的蛋白质可利用部分）、预测的蛋白质功效比（PER）、蛋白质体外消化率校正后的氨基酸评分（PDCAAS， 指氨基酸评分与蛋白质体外消化率的乘积）。

1.3.4 乳酸菌发酵饼干的品质评价参考文献[12]中的测定方法，并略有改动。 对最终发酵饼干样品的堆积高度和堆积质量、比容、饼干的硬度和脆性、pH 等进行研究， 对饼干各方面的品质进行客观的评价。 首先使用游标卡尺，随机取5 片发酵饼干样品，并对其堆积高度进行叠加测量，然后将堆垛的饼干顺时针旋转90°，按顺序依次旋转4 条边，最终结果取4 次测定的平均值。 同时，使用游标卡尺随机对5 片发酵饼干的长、宽、高进行测定，每组样品测定3 次，最终结果取其测定的平均值，使用以下式（2）计算饼干的比容。

式中：v为样品的比容，cm3/g；V为样品的体积，cm3；m为样品的质量，g。

使用TA-XT2i 型物性测试仪对乳酸菌发酵饼干的硬度、脆性进行测定。 取形状完整的一块饼干作为待测样品放置在实验支架上， 测试开始时，型号为TA-43R 的金属刀片（厚度为3 mm）垂直从饼干正中切过直至饼干断裂。 切刀上行速度、测试速度和下行速度分别为2.0、3.0、2.0 mm/s， 测试距离和接触力分别为5.0 mm 和5 g。 每组样品测定3次，结果取平均值。

1.3.5 乳酸菌发酵饼干的风味物质测定采用GC-2010PLUS 型气相色谱仪测定并分析4 种发酵饼干样品的风味物质成分。 将饼干粉碎后， 取约2.5 g 的饼干粉末， 放置在20 mL 的棕色进样瓶中，拧紧盖子后插入已老化的75 μm Car/PDMS 萃取头，60 ℃顶空萃取40 min，进行GC-MS 分析。

检测条件[13]：DB-5MS 毛细管色谱柱（60 m×0.32 mm，1 μm）；载气为氦气，以10 mL/min 恒流1 min 后分流，分流体积比10∶1。 升温程序：40 ℃恒温2 min，以6 ℃/min 的速率升温至160 ℃后保温2 min， 再以10 ℃/min 的速率升温至230 ℃后保温10 min。

1.4 数据处理

采用OriginPro 8 分析作图，SPSS 22 软件处理并分析数据，Duncan’s tests 进行方差分析（显著性分析）。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵饼干蛋白质体外消化率的研究

蛋白质体外消化率与蛋白质进入体内被人体消化吸收的程度密切相关。 一般来说，蛋白质体外消化率越高，说明蛋白质越易被肠胃利用[14]。 由图1可以看出，乳酸菌发酵饼干的蛋白质体外消化率在消化过程中变化情况一致。 在模拟人体的胃消化阶段，因为低pH 条件和胃蛋白酶的作用，消化过程中的大分子蛋白质被切断， 变成分子链较短的肽段，提高蛋白质消化。 但是，随着水解产物的增多，会影响消化的速率， 因此在模拟人体的胃消化阶段，蛋白质体外消化率有所升高但升高的不明显。 在模拟人体的肠消化阶段，加入胰酶后，因为胰酶的水解作用，蛋白质被降解为相对分子质量较小的多肽或者氨基酸，进一步提高肠消化阶段的蛋白质体外消化率[15]。

图1 不同消化阶段下发酵饼干的蛋白质体外消化率情况Fig. 1 In vitro digestibility of protein in fermented crackers at different digestion stages

在模拟胃消化阶段， 消化120 min 后，Control饼干的蛋白质体外消化率为16%，两种乳酸菌发酵饼干的蛋白质体外消化率约为17%，市售梳打饼干的蛋白质体外消化率为16%。 该结果显示Control饼干和市售梳打饼干在胃消化阶段的蛋白质体外消化率相近，但略低于乳酸菌发酵饼干的蛋白质体外消化率。 在模拟肠消化阶段，消化120 min 后，与Control 饼干和市售梳打饼干相比，DN-1 饼干的蛋白质体外消化率最高， 蛋白质体外消化率分别由81%、80%显著提高至86%， 而JN-1 饼干的蛋白体外消化率为84%， 相比于Control 饼干也有明显提高。 由此可以看出经乳酸菌酸面团发酵后可以显著提高发酵饼干在胃肠消化阶段的蛋白质体外消化率。 原因可能是乳酸菌酸面团在发酵过程中，面团中的乳酸菌产生的酸性物质激活了菌株自身和面粉中的蛋白酶类，蛋白酶将小麦粉中的蛋白质降解为小分子肽， 小分子肽进一步被降解为氨基酸，使其更容易被机体消化[16]。 该结果与闫博文等的研究结果[3]一致，相比于酵母发酵产品，加入乳酸菌发酵后会显著提高饼干在胃肠消化阶段的蛋白质体外消化率。

2.2 发酵饼干的蛋白质组分营养指标估算

食物中蛋白质的含量、氨基酸模式、必需氨基酸组成和含量等方面均存在差异，机体对不同种类蛋白质的利用也有所差异。 食品中蛋白质组分营养指标估算对食品营养价值的评价、膳食指导、新食品资源的开发等具有重要作用。 表2 为4 种发酵饼干的营养指标估算结果，发酵饼干的蛋白质组分营养指标估算主要包括： 必需氨基酸质量分数（EAA）、必需氨基酸与总氨基酸的质量比（E/T）、生物价（BV）、预测的蛋白质功效比（PER）、氨基酸评分（AAS）、蛋白质体外消化率校正后的氨基酸评分（PDCAAS）。 与Control 饼干相比，加入乳酸菌发酵后，多种营养指标差异不显著。 尽管饼干中加入的菌株和发酵工艺有所差异，但其配料和蛋白质组分相同，因此，蛋白质组分营养指标估算结果无显著变化。 与市售梳打饼干相比，Control 饼干、DN-1 饼干、 JN-1 饼干的多数营养指标估算结果均有一定程度的提高。

表2 4 种发酵饼干的蛋白质组分营养指标估算Table 2 Evaluation of nutritional indexes of protein components in four fermented crackers

2.3 发酵饼干的品质评价

发酵饼干会因发酵过程中菌株对面团的作用差异而产生不同的品质特性，4 种发酵饼干品质评价的测定结果如表3 所示。 由表可知，与Control 饼干相比，DN-1 饼干、 JN-1 饼干的堆积质量、堆积高度、比容均有所降低，可能是因为乳酸菌在面团发酵过程中会产生大量的酸性物质，有机酸会作用于面团网络结构，引起面团网络结构的塌陷，使面团的筋力减弱[17]；也有可能是因为乳酸菌与酵母的协同作用产生更多的二氧化碳气体，使发酵面团的密度降低[18]。此外，乳酸菌发酵饼干的硬度和脆性也均有显著的降低，且4 种发酵饼干的pH 均在7 左右。

表3 4 种发酵饼干的品质评价结果Table 3 Results of quality evaluation of four fermented crackers

2.4 乳酸菌发酵饼干的风味物质研究

在4 种发酵饼干中，一共检测到100 余种风味物质，这些风味物质主要有烷烃类、醛类、酯类、酮类、酸类、醇类和其他。 风味物质主要来源于原料自身、菌株发酵过程中的代谢物、焙烤过程中发生的美拉德反应以及脂质氧化等[19]。 4 种发酵饼干的风味物质如表4 所示，与Control 饼干相比，加入乳酸菌发酵后，酯类和酸类物质的相对含量和种类均有所增加，这些风味物质可以增加产品香气。

表4 4 种发酵饼干的不同风味物质统计Table 4 Statistics of different volatile flavor compounds in four fermented crackers

醇类物质是饼干风味的主要来源之一，在面团发酵过程中酵母和乳酸菌会通过代谢作用产生不同种类的醇类化合物，其中主要以正己醇、1-辛烯-3-醇、3,5-辛二烯-2-醇、 正丁醇和苯乙醇等为主。与Control 饼干和市售梳打饼干相比，DN-1 菌株发酵后其饼干中的醇类物质在相对含量和种类上均有明显的增加（P<0.05）；与Control 饼干相比，JN-1饼干中的醇类物质在相对含量上有所减少，但其醇类物质的种类有所增加，可能是不同的乳酸菌或者来源不同的同种乳酸菌的代谢途径有所不同引起的[20]。

醛类物质主要包括正辛醛、壬醛、反式-2-壬烯醛、苯甲醛等，检测到的酮类、酸类物质种类较多，而相对含量相对较低。 4 种发酵饼干中酮类、醛类、酸类物质在相对含量方面均存在差异， 其中，DN-1饼干、 JN-1 饼干中酸类物质的相对含量分别为5.02%、5.10%，明显高于Control 饼干和市售梳打饼干，该结果与Seitz 的研究结果[21]相似，主要是乳酸菌在面团发酵过程中产酸造成的。

酯类对产品风味影响明显，主要因为酯类物质有较低的阈值[22]。 4 种发酵饼干中共检测出40 种酯类化合物，Control 饼干和市售梳打饼干中分别有22、11 种酯类物质，相对含量分别为3.19%、3.00%。经乳酸菌发酵后，DN-1 饼干、 JN-1 饼干分别增加至26、32 种， 相对含量分别为13.88%、14.40%。 其中，在酵母单独发酵饼干中，具有白兰地酒香味的辛酸乙酯的相对含量为0.2%， 而在DN-1 饼干、JN-1 饼干中分别为0.2%、0.3%。在不同菌株发酵的样品中还检测到内酯类化合物， 其中，γ-丁内酯的形成主要是微生物的代谢作用产生了谷氨酸，并继续进行氧化脱氨反应产生2-氧戊二酸，经过脱羧还原反应后，最后环化生成γ-丁内酯[23]。 酯类物质的相对含量在乳酸菌发酵饼干中较高，可赋予产品浓郁的香气。

烷烃类物质的阈值较高，对饼干的风味贡献值低，而且多数烷烃类物质缺少生物活性，从结果来看，Control 饼干的烷烃类物质相对含量有所增加，经乳酸菌发酵后，饼干中烷烃类物质的相对含量均出现明显下降的趋势。 其他类物质包含不饱和烃类、呋喃等风味物质，相比Control 饼干和市售梳打饼干，在DN-1 饼干、 JN-1 饼干中这些风味物质的相对含量均有所降低。

3 结 语

作者以乳酸菌发酵制备的饼干为研究对象，探究两株不同的乳酸菌对饼干蛋白质体外消化率和品质特性的影响。 研究结果表明，与Control 饼干相比，乳酸菌发酵后饼干的蛋白质体外消化率均有显著提高，其中在模拟肠消化阶段，DN-1 菌株发酵饼干的蛋白质体外消化率达到最高。 同时，与市售梳打饼干相比，3 种发酵饼干 （Control 饼干、DN-1 饼干、JN-1 饼干） 的蛋白质体外消化率均有明显的增加。 此外，经乳酸菌发酵后，发酵饼干的风味品质有所改善，可赋予发酵饼干更好的感官特性。