对虾产品疫病双重荧光RPA 方法的建立和初步应用

张 娜， 谢艳辉， 仇保封， 郑舒尹， 斯泽恩， 李家侨*

（1. 湛江海关技术中心，广东 湛江 524000；2. 南通海关技术中心，江苏 南通 226004）

随着南美白对虾养殖规模不断扩大，对虾疫病的发生成为了对虾养殖业发展的瓶颈之一，为保护我国水产养殖业的健康发展，我国对进出口冷冻水产品的疫病监测项目逐渐增多，对出口贸易国家的水产品养殖的疫病评估更加严格。

传染性皮下及造血器官坏死病毒是引起对虾传染性皮下及造血组织坏死病（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，IHHN） 的病源[1]。 IHHNV 能够对其造成高的致病率和死亡率（90%）， 可以使斑节对虾以及凡纳滨对虾等出现矮小残缺综合征（runt-deformity syndrome，RDS），感染该病毒的对虾长不大，导致养殖产量大受影响，养殖过程中进行有效的生物安保措施是预防该病的最有效的方法[2]，而该病无有效的治疗方法。

虾肝肠胞虫是近几年新发现的寄生于对虾肝胰腺组织的新病原，尽管虾肝肠胞虫不会像对虾白斑病、黄头病、急性肝胰腺坏死病等急性传染病那样引起对虾大量死亡，但会导致虾生长缓慢，参差不齐，养殖效率急剧下降，给对虾养殖业带来了巨大损失[3-5]。

随着分子生物学技术的发展，目前出现了多种等温核酸扩增技术，如链置换扩增法（SDA）、转录介导扩增法（TMA）、解旋酶恒温基因扩增法（HAD）、环介导等温扩增法（LAMP）、重组酶聚合酶扩增法和重组酶介导扩增法（RAA）[6]。

重组酶聚合酶扩增是高威芳等研究出的一种新型等温DNA 扩增方法[7]，RPA 需要DNA 聚合酶、T4 重组酶、 单链DNA 结合蛋白 （SSB） 以及辅助DNA 聚合酶的蛋白质。 在模板DNA 链上匹配到互补链，并启动DNA 合成；不进行核酸解链和退火，在37 ℃即可进行核酸扩增； 在扩增体系中加入一个EXO 探针， 可以在扩增过程中实时监测荧光信号，通过收集荧光即可实现检测的实时监控。 该方法优点在于灵敏、 快速， 在20~30 min 即可完成检测，不需要复杂的机器进行热循环[8-9]。 RPA 技术已经被应用到多种动物病原的检测上，如鳗利斯顿氏菌[10]、寄生虫[11]、牛冠状病毒[12]、犬细小病毒[13]、流感病毒[14]等。

目前RPA 技术在虾类病原体检测方面的报道还比较少，为了方便病原监测，希望在重组酶聚合酶等温扩增核酸的基础上，开发出多重荧光RPA 方法。 本研究中应用实时荧光RPA 检测技术，根据虾肝肠胞虫（EHP）和传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）的保守序列设计引物、探针，实现对以上两种病原体的简便、快速、高效、高通量检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

centrifuge 5417R 高速冷冻离心机：Eppendorf公司；7500 荧光PCR 仪：ABI 公司；Q5000 核酸浓度分析仪：Qua Well 公司。

1.2 主要试剂

RPA 荧光检测试剂盒 （Twist Amp DNA Amplification Exo Kits）：TwistDx lnc 公司； DNeasy®Blood and Tissue Kit：Qiagen 公司；DNA 纯化回收试剂盒、质粒DNA 抽提试剂：TAKARA 公司；PCR 管等：Axygen 公司。

1.3 阳性样本

所使用的阳性样本为作者所在实验室保存的IHHNV 和EHP 阳性南美白对虾组织样本。

1.4 引物和探针设计合成

根据IHHNV 基因组序列（GenBank：JX258653），分析该病原体的特异性序列， 选择IHHNV 中非结构蛋白2（non-structural protein 2，NS2）和虾肝肠胞虫的核糖体小亚基（small subunit ribosomal，SSR）基因序列（GenBank MT539781.1）的保守序列设计引物、探针，具体引物、探针见表1。 引物、探针合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 双重荧光RPA 检测体系所用引物、探针序列Table 1 Primer and probe sequences for the duplex fluorescent RPA detection system

1.5 方法

1.5.1 组织样本DNA 提取取作者所在实验室保存的IHHNV 和EHP 阳性南美白对虾组织样本，放入1.5 mL 离心管中。 两个样本分别按照DNeasy®Blood and Tissue Kit 的说明提取DNA，存放于-20 ℃冰箱中待用。

1.5.2 阳性质粒构建取提取的IHHNV 和EHP的DNA，分别用设计的上下游引物进行PCR 扩增，扩增体系为：10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL，上下游引物各（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 μmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，提抽物5 μL，加水至25 μL。 扩增程序为：95 ℃3 min；95 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃1 min，35 个循环；72 ℃10 mim，4 ℃保存。 扩增产物进行测序分析和比对。

将10 μL PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，按照DNA 纯化回收试剂盒说明书进行回收； 将回收的扩增片段与pMD18-T 载体连接并转化和培养， 挑取单克隆进行质粒提取和PCR 鉴定后进行测序，测序结果与扩增基因的片段序列进行核苷酸序列同源性分析。 用核酸浓度分析仪测定提取的重组质粒的DNA 浓度。 将提取好的重组质粒作为本实验标准品，-20 ℃保存。

1.5.3 IHHNV、EHP 的荧光RPA 方法的建立以IHHNV 的阳性质粒为模板， 建立荧光RPA 检测体系， 反应体系为50 μL， 包括：Rehydration Buffer 25 μL，双蒸水15.4 μL，上游引物和下游引物各2.0 μL，探针为0.6 μL，模板5 μL（分别为阳性质粒、阴性对照、空白对照、EHP 的DNA 模板）。

以EHP 阳性质粒为模板， 建立荧光RPA 检测体系， 反应体系为50 μL， 包括：Rehydration Buffer 25 μL，双蒸水15.4 μL，上游引物和下游引物各2.0μL，探针为0.6 μL，模板5 μL（分别为阳性质粒、阴性对照、空白对照、IHHNV 的DNA 模板）。

以上反应体系溶液混匀后进行瞬时离心，然后加入到含有冻干粉的0.2 mL 的Twist Amp Exo RPA 反应管中， 充分混匀。 最后加入醋酸镁（280 mmol/L）2.5 μL，混匀后进行瞬时离心，分别将反应管放入检测仪器内检测。

扩增程序分别设置为：温度37 ℃，共30 个循环， 每个循环1 min， 每1 min 检测一次荧光信号；IHHNV 荧光信号检测通道为VIC，EHP 荧光信号检测通道为FAM。

1.5.4 双重荧光RPA 扩增体系的优化双重RPA荧光检测反应体系为50 μL， 包括：Rehydration Buffer 25 μL， 模板DNA 5 μL （模板样本分别为：IHHNV 和EHP 混合阳性质粒、 阴性对照、 空白对照），并对不同体积的引物、探针体系进行优化，所有组分加入后加水至50 μL。

第1 组：EHP-F、EHP-R 各1.5 μL，EHP-P 0.8 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各2.0 μL，IHHNV-P 0.6 μL。 第2 组：EHP-F、EHP-R 各2.0 μL，EHP-P 0.6 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各2.0 μL，IHHNV-P 0.6 μL。 第3 组：EHP-F、EHP-R 各2.0 μL，EHP-P 0.6 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各1.5 μL，IHHNV-P 0.8 μL。

每组体系中将以上加入的组分进行涡旋混匀，并在6 000 r/min 瞬时离心后加入到含有冻干粉的0.2 mL 的Twist Amp Exo RPA 反应管中， 充分混匀。 最后加入醋酸镁（280 mmol/L）2.5 μL，混匀并瞬时离心后放入检测仪器内检测。

扩增程序选择37 ℃，30 个循环，每个循环1 min，每个循环采集一次荧光信号；荧光信号检测通道选择FAM 和VIC。

1.5.5 双重荧光RPA 方法的特异性验证分别抽提IHHNV、EHP、 急性肝胰腺副溶血性弧菌（AHPND）、对虾白斑综合征病毒（WSSV）、虾传染性肌肉坏死病毒（IMNV）、虾基因组、鱼基因组的核酸样本。 将上述7 种病原体样本混合测试，以检验建立的反应体系对EHP 和IHHNV 的检测特异性，以及对干扰核酸的抗干扰检测能力。

1.5.6 双重荧光RPA 方法的灵敏度验证将建立好的IHHNV 阳性质粒和EHP 阳性质粒分别进行稀释， 得到1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL共5 个浓度梯度。 每个浓度模板分别测试3 个重复，以测试建立方法的灵敏度。

1.5.7 双重荧光RPA 方法的重复性验证将建立好的IHHNV 阳性质粒和EHP 阳性质粒分别进行稀释， 混合至浓度均为2×103copies/μL， 重复检测10 个模板，来验证方法的重复性。 分别计算各自的CT 值的变异系数（CV），计算公式为：

式中：CV为10 个检测CT 值的变异系数，%；S为10个检测CT 值的标准偏差；X为10 个检测CT 值的算术平均值。

1.5.8 双重荧光RPA 方法的实际样本检测及方法学对比进口冷冻带头对虾样本共20 份， 每份样本30 只虾， 无菌采集虾鳃和肝胰腺等器官制备成一份混合样本。 分别进行组织匀浆和离心并提取核酸。 每个样本取5 μL 核酸分别用建立的双重荧光RPA 方法检测， 同时每个样本用荧光PCR 方法进行平行对比。

2 结果与分析

2.1 IHHNV 和EHP 的荧光RPA 方法的建立

分别以阳性质粒、阴性对照、空白对照、EHP 或IHHNV 的DNA 作为模板， 建立IHHNV 和EHP 荧光RPA 检测体系。 IHHNV 荧光RPA 方法扩增结果如图1 所示， 可以看出只有IHHNV 阳性质粒扩增明显，EHP 的DNA 模板、阴性对照、空白对照均没有扩增；EHP 荧光RPA 方法扩增结果如图2 所示，结果只有EHP 阳性质粒有明显扩增，IHHNV 的DNA 模板、阴性对照、空白对照均没有扩增。结果证明IHHNV、EHP 的荧光RPA 方法构建成功。

图1 IHHNV 荧光RPA 方法扩增结果Fig. 1 Amplification results of IHHNV by fluorescent RPA method

2.2 双重荧光RPA 方法扩增体系的优化

分别设置3 组不同体积的引物、探针体系，IHHNV选择VIC 荧光信号检测通道，EHP 选择FAM 荧光信号检测通道。3 组体系扩增结果如图3~5 所示。由图3 可以看出， 第1 组的扩增效果最好，IHHNV 和EHP 阳性质粒扩增曲线均匀性最好， 扩增效率最高；而第2 组的IHHNV 阳性质粒扩增效率差（见图4）；第3 组的IHHNV 和EHP 的阳性质粒扩增效率最差（见图5）。综合比对，第1 组的体系扩增效果最优， 即EHP-F、EHP-R 各1.5 μL，EHP-P 0.8 μL；IHHNV-F、IHHNV-R 各2.0 μL，IHHNV-P 0.6 μL。

图3 第1 组引物、探针体系扩增结果Fig. 3 Amplification results of the first set of primer and probe system

图4 第2 组引物、探针体系扩增结果Fig. 4 Amplification results of the second set of primer and probe system

图5 第3 组引物、探针体系扩增结果Fig. 5 Amplification results of the third set of primer and probe system

2.3 双重荧光RPA 方法特异性验证结果

使用IHHNV、EHP、AHPND、WSSV、IMNV、 虾基因组、鱼基因组的核酸，将上述7 种病原体核酸混合测试，检验所建立的双重荧光RPA 方法的特异性。 结果如图6 所示，IHHNV 和EHP 的DNA 样本检测结果扩增曲线明显，其余5 种核酸样本都未见明显的扩增曲线。

图6 双重荧光RPA 方法特异性验证结果Fig. 6Specificity verification results of the duplex fluorescent RPA method

2.4 双重荧光RPA 方法灵敏度验证结果

将建立好的IHHNV 阳性质粒和EHP 阳性质粒分别进行稀释， 得到1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101copies/μL 共5 个浓度梯度。 每个浓度模板分别测试3 个重复，以测试建立方法的灵敏度。 检测结果如图7 显示，1×105~1×102copies/μL 的样本均有明显的扩增曲线，1×101copies/μL 的样本扩增曲线接近水平。 可见建立的双重荧光RPA 方法对IHHNV 阳性质粒和EHP 阳性质粒的检测灵敏度可以达到1×102copies/μL。

2.5 双重荧光RPA 方法重复性验证结果

将建立好的IHHNV 阳性质粒和EHP 阳性质粒分别进行稀释，混合至浓度均为2×103copies/μL，重复检测10 个模板，来验证方法的重复性，分别计算各自的CT 值的变异系数，IHHNV 检测的CT 值分 别 为 20.12、19.54、19.01、19.83、19.72、19.53、20.03、19.89、19.47、19.88， 变异系数为1.65%；EHP检测的CT 值分别为17.12、17.24、17.35、17.46、17.92、18.21、18.31、17.65、17.94、17.46，变异系数为2.32%。 具体结果如图8 所示，双重荧光RPA 方法对于IHHNV 和EHP 的重复性验证结果较好。

图8 双重荧光RPA 方法重复性验证结果Fig. 8 Repeatability verification results of the duplex fluorescent RPA method

2.6 实际样本检测及方法学对比结果

进口冷冻带头对虾样本共20 份， 每个样本取5 μL 核酸分别采用建立的双重荧光RPA 方法进行检测， 同时每个样本用荧光PCR 方法进行平行检测。 由图9 可以看出，采用双重荧光RPA 检测出1例EHP 阳性和1 例IHHNV 阳性。荧光PCR 方法检测结果与双重荧光RPA 方法结果一致（见图10）。

图9 双重荧光RPA 方法检测20 例实际样本的结果Fig. 9 Results of 20 clinical samples detected by the duplex fluorescent RPA method

图10 荧光PCR 方法检测20 例实际样本的结果Fig. 10 Results of 20 clinical samples detected by the fluorescent PCR method

2.7 讨论

IHHNV 感染可以在对虾生长的整个周期，对虾感染IHHNV 后，可能会终身带病毒，并通过垂直传染途径感染子代，或透过食物链和污染水质等引起水平感染[15-16]。 目前，虾肝肠胞虫的传播越来越广泛，有研究表明在中国、印度尼西亚、马来西亚、越南、印度和泰国等国家均有检出[17]。 EHP 感染在苗种培育和成虾养殖阶段均有出现，严重影响对虾的生长速度和成虾品质，给该产业带来巨大的经济损失，在亚洲地区每年损失上亿美元[18]，特别是和其他疫病混合感染时，使对虾疫情加重，增加致死率。

IHHNV 和EHP 两种疫病都会引起对虾生长缓慢，影响投入产出比，当幼虾出现生长缓慢、死亡率高的情况时，就需要养殖人员快速和准确地判断出病原，以及时作出预防和治疗方案来减少发病引起的更大损失。 所以，对于这两种疫病的区分检测具有重要的临床意义。 特别是当临床出现混合感染的时候，建立IHHNV 和EHP 的双重检测方法可以为确定病原节省更多的时间。

澳大利亚作为全球动植物检验检疫最严格的国家之一，一直以来对进口的生虾仁、面包虾、去头虾等产品采取严格的检疫措施[19]，使养殖企业和生产企业的负担加重，给我国虾生产企业，乃至整个虾产业造成了严重的经济和社会影响，严重影响了对虾进出口贸易和对虾养殖产业的发展。 所以，针对冷冻水产品的疫病监测，全球各个国家所制定的检疫措施也越来越严格。 因此，必须足够地重视和关注原料、生产线及成品质量，加强企业对疫病检疫的力度，降低企业的生产成本和出口风险。

王金凤等构建了猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增检测方法（RT-RPA 方法），该方法的检出限为1.0×102copies/μL[20]。 万文妍等将重组酶聚合酶扩增（RPA）与胶体金侧向流试纸条（LFD）技术联合，建立了禽腺病毒血清4 型RPA-LFD 快速检测方法， 该方法的最低检出限为1.0×102copies/μL， 可用肉眼直接观察结果[21]。 杨洋等建立了口蹄疫病毒实时荧光反转录重组酶聚合酶扩增检测方法，该方法特异性较高， 重复性好， 灵敏度为5.0×102copies/μL，与RT-qPCR 检测结果具有100%的符合率[22]。 作者从临床应用考虑建立双重荧光RPA 方法，对方法的特异性、灵敏度和重复性进行验证，结果显示所建立的方法只对IHHNV 和EHP 的核酸样本有明显的扩增， 而对其他病原和宿主基因均不会扩增；IHHNV 和EHP 阳性质粒的检测灵敏度可以达到1×102copies/μL，表明方法的灵敏度较高。 同时，进行重复性验证，结果显示方法重复性较好。

目前，对于对虾疫病的主流方法是荧光PCR 和普通PCR 方法[23-24]，这些方法均需要使用荧光定量PCR 仪和普通PCR 仪，设备需要使用220 V 交流电源，需要在实验室环境下使用，不利于在野外实施检测； 同时荧光定量PCR 方法需要循环升降温，检测时间比较长，一般需要1.0~1.5 h。

使用本文中建立的方法对进口冻虾进行检测，检出1 例EHP 感染和1 例IHHNV 感染，同时用荧光PCR 方法进行比对检测，两种方法的检测结果一致。 但是，双重荧光RPA 方法中的弱阳性样本扩增曲线效率更高，同时双重荧光RPA 方法的检测速度明显短于荧光PCR 方法。

3 结 语

当前，疫病检测的要求越来越严格，不仅要缩短检测时间，还要提高检测灵敏度，在这样的要求下，需要开发出更多快速、简便、灵敏度高的检测方法。 重组酶聚合酶扩增技术是恒温核酸扩增技术的一种，该方法灵敏、快速，有着广阔的应用前景[25-27]。本研究中建立了同时检测IHHNV 和EHP 的双重荧光RPA 方法，不需要使用复杂的设备，在现场即可以检测，并且检测时间可以缩短到20~30 min。

目前， 对于双重疫病RPA 检测方法的报道较少，所以对于多重荧光RPA 方法的建立还需要更多的研究，比如较高要求的引物设计。 进行引物设计时，需要注意：RPA 的5′端3~5 个碱基处，最好是嘧啶碱基（T/C），不要出现G，嘧啶有利于引物与重组酶形成复合体；RPA 的3′端最好是G/C， 这样引物与模板的结合更稳定。 本研究中建立的双重荧光RPA 方法的引物、探针的设计是依据Twist Amp TM Basic Kit 中的说明书进行操作，首先找到一对碱基T，这对T 碱基被1~5 个碱基隔开，靠近5′端T 碱基被荧光基团取代，3′端T 碱基被淬灭基团取代，在隔开的中间碱基中挑一个用THF（tetrahydrofuran）取代；从5′端到荧光基团至少30 个碱基，从3′到淬灭基团至少15 个碱基，且3′端碱基需要被修饰。

虽然双重荧光RPA 方法还有很多需要改进的地方，但是其不可忽视的特点和优势会使该方法应用前景广阔，对于临床养殖场的病原筛查具有重要意义。