蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR 法检测

林碧莲， 张雅薇， 高 宇， 何孟杭， 邱秀玉， 韩 涛，张 芳， 傅德江， 陈思琪， 宋 帆， 柯振华

（福建省产品质量检验研究院国家加工食品质量监督检验检测中心(福州), 福建 福州 350002）

转基因作物具有产量大[1]、利润多[2-3]、抵抗力强[4-7]及其他特性[8]等优势，在全球种植面积不断扩大[9]。 对于转基因作物的安全性，一直存在激烈争议，目前还未有足够证据可以证明它对人体和环境无副作用，科技界也未有定论。 人们对转基因作物的发展不断提出安全问题， 如基因编辑过程中，由于无意的基因转移和环境释放，可能给环境和人类带来风险和不确定性[10-16]。 科学家也发现随着基因的流动，转基因作物基因流向非转基因作物[17-18]，并已逐渐渗透到食物中，如蜂蜜[19-21]。

我国是全球最大的蜂蜜生产国和出口国，约占全球蜂蜜出口量的1/4， 大部分蜂蜜生产者是个体养蜂者，蜂蜜的蜜源植物没有限定，随着转基因植物种类、数量的不断增加，蜜源植物中的转基因植物比例相应也会不断增加，蜜蜂采到转基因植物花粉的可能性也就越大。 我国对转基因作物一直采取的是谨慎的态度和严格的管理，为了规范转基因作物对人们带来的潜在危险，国家相关部门出台了政策规范，也制定一些标准进行监测。 但转基因技术发展迅猛，转基因成分越来越多样化，对应的检测技术也需不断提高。

至今，大多数转基因植株都含有pCaMV35S 和（或）tNOS。 但在一些新的转基因结构中，pCaMV35S和tNOS 完全缺失。 现已出现的其它启动子和终止子 还 有 pFMV35S、pNOS、pSSuAra、pTA29、pUbi、tCaMV35S、tE9、tOCS、tg7 等[22]，国家相关部门也出台了检测标准进行筛选[23]，均为单重实时荧光PCR法。若采用单重实时荧光PCR 技术对蜂蜜开展上述所有启动子和终止子的检测，量大效率低，而多重实时荧光PCR 技术一管多检， 可实现高效率的检测，在转基因产品检测中已得到了广泛应用[24-30]，但专门针对蜂蜜中启动子和终止子的多重实时荧光PCR 反应体系未见报道。

目前转基因作物中启动子和终止子主要以pCaMV35S 和tNOS 为主，含有至少两者之一的作物所占比例为85%以上[29]，据文献报道，启动子pSSuAra 和pTA29 一般同时出现， 只需测试其中一种[22]。 基于此，本研究中先建立pCaMV35S 和tNOS的双重实时荧光PCR 反应体系，剩余8 种启动子和终止子建立两组四重实时荧光PCR 反应体系，双重实时荧光PCR 进行初步筛选，未检出的样品再采用另外两组四重实时荧光PCR 进行检测。 由10 次的检测变成3 次检测，降低检测成本、扩大检测范围、提高工作效率，为蜂蜜中转基因成分的检测提供一种更为高效的检测技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品及试剂40 份蜂蜜样品：市售；GoTaq qPCR Master MIX 预混液：普洛麦格（北京）生物技术有限公司；高效植物基因组DNA 提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 实验所用转基因质控品转基因油菜GT73/RT73 种子粉末（GT73/RT73）、转基因油菜Ms1 叶子组织的基因组DNA（Ms1）、转基因玉米MON88017种子粉末（MON88017）、马铃薯转基因成分（EH92-527-1）：AOCS （美国石油化学家学会）； 转基因棉籽、转基因大豆种子粉末（GTS-40-3-2）：欧盟委员会联合研究中心； 转基因玉米种子粉末（QC-GM-008）、 转基因玉米 MON89034 种子粉末（MON89034）、 转基因玉米Bt11 品系种子粉末（Bt11） 、非转基因大豆种子粉末（QC-GM-001）、转基因大豆89788 种子粉末（89788）、转基因大米种子粉末（QC-GM-018） ：中国检验检疫科学研究院测试评价中心；转基因玉米酒糟粕U862（U862）、非转基因玉米酒糟粕J331（J331）：作者所在实验室收集。

1.2 仪器与设备

ABI 7500 荧光PCR 仪： 美国Life Tech 公司；Mini spin 小型离心机： 德国Eppendorf 公司；IKA MS3 basic 涡旋混合器： 上海琪特分析仪器有限公司；CR22GⅢ落地式冷冻离心机：日本Hitachi KoKi公司；Ultrospec 2100pro 紫外可见分光光度计：美国GE 公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜样品和转基因质控品DNA 的提取蜂蜜样品于50 ℃水浴20 min 至充分融化， 上下颠倒混匀。取20 g 的蜂蜜至50 mL 的离心管中，各2 管，加40 ℃的纯化水30 mL，振荡混匀溶解，4 500 r/min离心10 min， 去上清液， 加1 mL 的纯化水溶解沉淀，吸出至2 mL 离心管中，4 500 r/min 离心10 min，再用纯化水清洗后4 500 r/min 离心10 min，去上清液，所得沉淀根据试剂盒说明书提取DNA。 转基因质控品根据试剂盒说明书进行DNA 提取。

1.3.2 引物、探针的筛选及配对测试通过查阅文献及参考行业标准，以pCaMV35S、tNOS、pFMV35S、pNOS、pUbi、pTA29、tE9、tOCS、tg7、tCaMV35S 为研究靶标，采用国家标准GB/T 19495.4—2018[23]中的引物、探针序列，选择吸光度差异比较大的JOE、ROX、FAM、CY5 作为多种探针的发光基团，10 种引物、探针分成3 组，pCaMV35S 和tNOS 为一组，pFMV35S、pNOS、pUbi、pTA29、tE9、tOCS、tg7、tCaMV35S 的引物和探针进行组合测试，确定两组四重实时荧光PCR 反应引物和探针的最佳组合，采用真核生物内参基因18S rRNA 验证是否提取到试样DNA，所用引物、探针的序列及最佳组合见表1，引物、 探针均委托上海生工生物工程有限公司合成。

表1 3 组多重实时荧光PCR 反应体系引物、探针序列Table 1 Three groups of multiple real-time fluorescent PCR systems primers and probes sequence

1.3.3 多重实时荧光PCR 反应条件的优化根据前期筛选测试情况，对3 组多重实时荧光PCR 反应体系进行优化 （见表2）。 反应体系总体积25 μL，GoTaq qPCR Master MIX 预混液12.5 μL，模板DNA 2 μL，引物对（10 μmol/L）和探针（10 μmol/L）根据表2 中的加量进行测试，水补足至25 μL。多重实时荧光PCR 扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，共进行45 个循环，每个循环结束后收集荧光信号。 先优化引物、探针体积，再进行退火温度的测试，测试温度为58、60、62 ℃。

表2 3 组多重实时荧光PCR 体系引物探针的优化Table 2 Optimization of primers /probes for three groups of multiple real-time fluorescent PCR systems

1.3.4 多重实时荧光PCR 反应体系灵敏度的测试以质量浓度为100 ng/μL 的QC-GM-008 DNA 为原液，用纯化水进行梯度稀释，获得质量浓度分别为100、 10、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL 的灵敏度测试样品，进行双重实时荧光PCR 扩增，每个样品4 个平行， 以确定双重实时荧光PCR 反应体系的灵敏度。因找不到同时含有10 种目的基因的阳性对照样，本研究中以转基因油菜Ms1 叶子组织的基因组DNA、 转基因油菜GT73/RT73 种子粉末提取的DNA 和转基因棉籽提取的DNA， 分别稀释到120 ng/μL 后，各取相同量混匀，再用纯化水进行梯度稀释， 获得质量浓度分别为40、4.0、0.4、0.04、0.004 ng/μL 的灵敏度测试样品， 进行四重实时荧光PCR扩增，每个样品4 个平行，以确定两组四重实时荧光PCR 反应体系的灵敏度。

1.3.5 多重实时荧光PCR 反应体系质控品测试比对选取国内外权威机构的12 份转基因质控品和2 份作者所在实验室自备的转基因样品，提取其基因组DNA 为模板， 分别进行单重实时荧光PCR 扩增和多重实时荧光PCR 扩增，验证这3 组多重实时荧光PCR 反应体系的准确性。

1.3.6 40 份市售蜂蜜样品转基因启动子和终止子的多重实时荧光PCR 法检测提取40 份市售蜂蜜样品的DNA，进行真核生物内参基因18S rRNA 的检测，确认提取到DNA 后，进行双重实时荧光PCR初步筛选，阴性样品采用A 组四重实时荧光PCR 进行检测，再次阴性样品采用B 组四重实时荧光PCR进行检测。

2 结果与分析

2.1 多重实时荧光PCR 反应条件的优化

为实现快速筛选蜂蜜中是否含有转基因成分，选用10 种启动子和终止子进行多重实时荧光PCR扩增。 为实现同一管中检测多对目的基因，调整反应条件和反应程序，最终结果为：3 组多重实时荧光PCR 的退火温度均为60 ℃， 反应体系总体积25 μL，其中GoTaq qPCR Master MIX 预混液12.5 μL、模板DNA 2 μL。 双重实时荧光PCR 引物和探针的添加体积最优组为第3 种组合： 发光基团为FAM的上下游引物各为0.5 μL、探针为0.25 μL，发光基团为JOE 的上下游引物各为1 μL、探针为1 μL，共4.25 μL；加水6.25 μL。 两组四重实时荧光PCR 引物和探针的添加体积最优组为第4 种组合：发光基团为FAM 的上下游引物各为1 μL、探针为0.5 μL，发光基团为JOE 和CY5 的上下游引物各为1 μL、探针为1 μL， 发光基团为ROX 的上下游引物各为0.5 μL、探针为0.25 μL，共9.75 μL；加水0.75 μL。3 组多重实时荧光PCR 的10 种靶基因均能扩增，CK 为空白试剂，扩增曲线如图1~3 所示，曲线无重叠，辨识度高，荧光强度到达设定的域值时所经历的循环数（CT 值）差异最小，CT 值均小于28，符合国内转基因国家标准[23]和行业标准[31-32]阳性对照的要求。

图1 双重实时荧光PCR 扩增曲线Fig. 1 Amplification curves of dual real-time fluorescence PCR

图2 A 组四重实时荧光PCR 扩增曲线Fig. 2 Amplification curves of group A with quadruple real-time fluorescence PCR

图3 B 组四重实时荧光PCR 扩增曲线Fig. 3 Amplification curves of group B with quadruple real-time fluorescence PCR

2.2 3 组多重实时荧光PCR 反应体系灵敏度的测试

将含目的基因的阳性样品进行一系列稀释，进行3 组多重实时荧光PCR 反应体系灵敏度的测试，结果为：双重实时荧光PCR 在DNA 质量浓度为100、10、1.0、0.1、0.01 ng/μL 时， 两条曲线均扩增正常；A 组四重实时荧光PCR 在DNA 质量浓度为40、4.0、0.4、0.04 ng/μL 时，4 条曲线扩增正常，当阳性样品DNA 质量浓度为0.004 ng/μL时只有pFMV35S 和pUbi 有扩增；B 组四重实时荧光PCR 在DNA 质量浓度为40、4.0、0.4、0.04 ng/μL 时，4 条曲线扩增正常， 当阳性样品DNA质量浓度为0.004 ng/μL 时只有tCaMV35S 有扩增， 所以3 组多重实时荧光PCR 反应体系的灵敏度分别是0.01、0.04、0.04 ng/μL， 扩增CT 值见表3 和表4。

表3 双重实时荧光PCR 双重实时荧光PCR 反应体系的灵敏度Table 3 Sensitivity of dual real-time fluorescence PCR system

表4 两组四重实时荧光PCR 反应体系的灵敏度Table 4 Sensitivity of two groups of quadruple real-time fluorescence PCR systems

2.3 3 组多重实时荧光PCR 反应体系质控品测试比对

对14 份转基因质控品进行单重和多重实时荧光PCR 检测比较分析，结果表明两种方法检测的结果一致 （见表5）。 12 份转基因阳性质控品中检出pCaMV35S 有9 份，检出tNOS 有9 份，检出pFMV35S有4 份，检出pTA29 有1 份，检出tOCS 有1 份，检出pUbi 有6 份， 检出tCaMV35S 有3 份， 检出tg7有1 份，检出tE9 有2 份，检出pNOS 有2 份，含单一启动子和 （或） 终止子的质控品有1 份， 不含pCaMV35S 和tNOS 的质控品有2 份。阴性质控品均未检出启动子和终止子。

表5 多重实时荧光PCR 反应体系适用性验证结果Table 5 Applicability verification results of multiple real-time fluorescence PCR reaction systems

2.4 40份市售蜂蜜样品转基因启动子和终止子的检测结果

40 份市售蜂蜜样品提取的DNA 经18S rRNA内参基因检测均为阳性，经3 组启动子和终止子的多重实时荧光PCR 法检测， 有两份样品检出pCaMV35S 和tNOS，其余未检出。 至今我国实现大规模商业化生产的转基因作物只有抗虫棉和抗病番木瓜，蜂农养的蜜蜂受到指引，采到这些植物的可能性低，而本文中测试的蜂蜜样品为市面上流通产品，不是专门的抗虫棉和抗病番木瓜蜂蜜，阳性样品检出率低属正常现象。

3 结 语

启动子是位于基因5′端上游的DNA 序列，能活化RNA 聚合酶，使之与模板DNA 准确的结合并具有转录起始的特异性，没有启动子的目的基因就无法在细胞中启动复制。 终止子是指终止RNA 转录的DNA 序列。 插入的外源基因在细胞中要正常表达均需要有启动子和（或）终止子。

多重实时荧光PCR 已是国内常用检测技术，据文献报道，现有多重实时荧光PCR 主要针对某种或某类植物，检测同一品系的转基因成分或常见转基因成分的组合， 比如董立明等建立的CaMV35S 启动子、NOS 终止子、Cry1Ab/Ac 基因、HPT 基因和SPS 水稻内标基因的组合， 用于检测水稻转基因成分[33]；邢珍娟等基于DAS40278-9、BLVA430101、pCaMV35S、tNOS、Cry1Ab/Ac 基因、pat 基因和内源基因zSSIIb 建立的五重实时荧光PCR 和双重实时荧光PCR 检测玉米转基因成分[34]；邵彪等基于pCaMV35S、tNOS 和NPTII 基因建立的多重实时荧光PCR，用于检测肉制品转基因成分[35]。而蜂蜜中的蜜源植物多样，难以定位到它可能含有的某种转基因植物花粉，筛选难度大，该研究以启动子和终止子为研究对象，建立多重实时荧光PCR 反应体系进行初筛，实现大范围快速检测，以精准定位转基因可疑阳性样品，提高检测效率。

本研究中建立的3 组多重实时荧光PCR 反应体系， 能准确地检测14 份转基因质控品的启动子和终止子，具有很好的适用性，灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL，可对大批量、未知转基因成分的蜂蜜进行检测。 这种高效的检测手段，可为我国蜂蜜中转基因成分的检测提供一定的技术支撑，同时也适用于其它产品转基因成分的检测。