外套膜转录物组分析揭示尿素在贻贝耐受海水酸化中的作用

刘 菲, 范孝俊, 王 莹, 李迎澳, 张晓林, 严小军, 廖 智

(浙江海洋大学 海洋科学与技术学院,海洋生物资源与分子工程实验室, 浙江 舟山 316022)

随着人类生产活动中化石燃料消耗的急剧增加,越来越多的二氧化碳排放导致了海洋酸化(ocean acidification)现象的产生。海洋酸化导致了海水中碳酸根离子浓度下降,氢质子浓度上升,同时也导致海水中碳酸钙分子饱和度下降,因此,海洋酸化对以碳酸钙为其钙化组织的海洋矿化生物产生了严重威胁。目前已知海洋酸化对珊瑚、藤壶、贝类以及部分藻类等海洋生物的生物矿化过程产生抑制作用,也由此对上述海洋生物的繁殖、发育、以及生长过程造成影响,最终导致严重的生态问题[1]。贝类因其较高的经济价值而成为目前海洋水产养殖的主要物种,因此,海洋酸化对贝类及其养殖业的影响日益受到重视,海洋酸化对贝类的影响相关研究也已较为深入。已有的研究表明,海洋酸化对贝类贝壳的形成、发育以及力学性能具有不利影响[2],特别是对贝类幼虫发育过程中,贝壳形成的关键环节产生抑制而造成贝类幼虫发育迟缓甚至大规模死亡的现象[3]。进一步的研究表明,海洋酸化通常会导致贝类贝壳形成相关蛋白质的表达量变化。例如,酸化会导致太平洋牡蛎(Crassostreagigas)贝壳基质蛋白质(shell matrix proteins,SMPs)的表达出现异常,并导致贝壳发育的延迟[4];酸化也会导致马氏珠母贝(Pinctadafucata)钙结合蛋白质的表达异常,并导致贝壳钙化速率下降[5];此外,酸化还会导致蓝贻贝(Mytilusedulis)外套膜中几丁质酶以及钙结合蛋白质的表达量下降[6]。可见,海洋酸化对贝类生物矿化的影响的可能机制在于酸化对贝壳形成过程中的相关调控蛋白质的表达产生干扰,从而抑制了贝壳的形成与发育。此外,海洋酸化还会导致贝类出现新陈代谢异常,例如能量代谢抑制,细胞膜极化的影响等,从而间接对贝壳形成过程中的能量消耗产生了影响[7-9]。

值得关注的是,贻贝属贝类在前期研究中表现出对海洋酸化的耐受性。例如,Thomsen等人很早即观察到贻贝Mytilus edulis在食物供应充分的情况下,可以有效对抗海洋酸化的影响,并在部分高二氧化碳浓度的海域发展成为优势物种[10];此后,Fitzer等人发现贻贝属在酸化条件下,仍能维持其贝壳的生物矿化过程,尽管付出了贝壳形态结构异常的代价[1];Matoo等人的研究进一步表明,贻贝通过调节其能量供应及代谢过程来对抗海洋酸化对其不利影响,从而表现出对海洋酸化的耐受性[11]。此外,贻贝属在酸化条件下,能通过增强代谢过程中内源性碳酸根离子的吸收,从而维持其贝壳中方解石型和文石型碳酸钙晶体的形成[12]。由此可见,贻贝属在海洋酸化大背景下,可能有其特殊的分子机制来维持其贝壳的生物矿化过程以适应环境pH的下降。

生物矿化是贝类通过贝壳基质蛋白质(shell matrix protein, SMP)调控碳酸根离子和钙离子形成碳酸钙晶体,并进一步形成贝壳的过程。在这一过程中,碳酸根离子的来源可分为外源性和内源性两种;其中,外源性碳酸根离子主要来自于海水中的无机碳,而内源性碳酸根离子主要来自于贝类代谢过程中所产生。Lu等人发现,海洋酸化会导致贻贝贝壳中外源性无机碳含量的下降[13]。而Zhao等人的研究表明,海洋酸化条件下,贝类会通过增强其内源性碳酸根离子参与贝壳形成的过程[14]。由此可见,对贝类而言,内源性碳酸根离子对其贝壳形成具有重要作用,也因此可能成为其对抗海洋酸化对贝壳形成的不利影响的主要机制。贝类可通过多种代谢机制产生内源性碳酸根,例如呼吸作用[15]以及尿素降解[16]等。但目前对于贝类依赖何种途径产生的内源性碳酸根离子参与贝壳的生物矿化尚无明确结论。值得关注的是,前期研究已发现,尿素在脲酶降解下所产生的碳酸根离子在部分微生物中参与了生物矿化过程[17, 18];此外,厚壳贻贝中也已发现酸化会导致其脲酶表达量上调[19],且稳定同位素分析表明,尿素可参与其贝壳碳酸钙的形成[20]。为此,我们推测,尿素及其降解产物可能在贻贝对海洋酸化的耐受过程中具有重要作用。为进一步研究尿素对贻贝在海洋酸化条件下的分子响应过程的影响,采用转录物组学技术,对厚壳贻贝外套膜在正常海水以及酸化海水条件下开展高通量测序,以探讨贻贝在海洋酸化过程中,尿素的添加所造成的生理响应以及贻贝应对海洋酸化的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 厚壳贻贝的采集与处理

将采集自浙江舟山嵊泗海域的成年厚壳贻贝(长度70 ～ 80 mm),以洁净天然海水(pH 8.1,盐度25 ‰)在22 ℃恒温水族箱中暂养7 d。暂养后的贻贝随机分为3组,每组18只贻贝个体。第1组养殖于天然海水(pH 8.1),命名为CN(complete-shell in normal seawater )组,第2组养殖于酸化海水(pH 7.4),命名为CA(complete-shell in acidified seawater)组,第3组经后闭壳肌注射尿素(1 mg/mL,注射体积20 μL)后养殖于酸化海水(pH 7.4),命名为CAU (complete-shell in acidified seawater with urea injection)组。第1组和第2组贻贝在后闭壳肌注射20 μL无菌海水为对照。上述3组贻贝注射后养殖时间均为48 h。酸化海水pH值采用海水酸化仪(Starfish SF0S02, 中国青岛)自带的pH计进行测量,并利用偶联的CO2泵通过控制CO2气体流量进行pH值调节;所有贻贝在饲养期间均以螺旋藻粉进行定时投喂。

1.2 RNA提取与测序

取上述3组贻贝,分别收集其外套膜组织。经液氮研磨后采用Trizol法提取总RNA;采用分光光度计(Nanodrop 2000)对所提RNA的浓度和纯度进行检测,并以琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性,Agilent 2100测定总RNA的RIN值。采用带有Oligo(dT)的磁珠从总RNA中分离富集出mRNA;再对所富集的mRNA进行随机打断,获得片段化的mRNA(长度约300 nt);对片段化的mRNA采用六碱基随机引物进行逆转录,获得双链cDNA后,对其进行末端补平并添加接头碱基;之后对所得双链cDNA进行富集和定量处理,进行cBot桥式PCR扩增,生成clusters后利用Illumina Novaseq 6000 平台(上海美吉公司)对其进行高通量测序。

1.3 转录物组数据处理与生物信息学分析

采用软件SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle (https://github.com/najoshi/sickle)对Illumina测序所得原始数据进行修剪,去除接头和低质量的阅读子(reads);采用RSeQC (版本v2.3.6)进行测序数据的质控分析。参照文献方法[21],将测序数据与厚壳贻贝参考基因组(数据库编号:PRINA578350)进行比对;参照文献方法[22],进行转录物组序列组装。组装后的转录本序列经BLASTX比对,分别注释于非冗余蛋白质数据库(Non-Redundant protein databank, NR)、基因本体数据库(Gene Ontology,GO)、京都基因百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)、蛋白质直系同源簇数据库(Cluster of Orthologous Group,COG)、SWISS-PROT蛋白质序列数据库、以及蛋白质结构域数据库(PFAM),以HMMER为默认参数,E值小于1.0e～5作为阈值。

利用Bowtie 程序[23]将高质量干净阅读子(clean reads)映射到组装的转录本。为鉴定不同样本组间的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs) ,根据每百万读数(Transcripts Per Million,TPM)法计算每个转录本的表达量水平。使用 RSEM软件 (http://deweylab.biostat.wisc.edu/RSEM/)来量化基因丰度[24]。DEGs采用软件DESeq2[25]进行筛选,筛选条件为∣ log2FC ∣ >1且q值≤0.05。此外,分别采用软件Goatools (https://github.com/tanghaibao/Goatools)和 KOBAS (http://KOBAS.cbi.pku.edu.cn/home.do)[26]进行差异表达基因的GO和 KEGG 功能富集分析。同时,对组间DEGs开展基因集富集(gene set enrichment analysis,GSEA)分析,以便尽量准确地反映基因集在不同组间的功能注释差异。

1.4 转录物组数据的荧光定量PCR验证

对上述3组样本的转录物组测序数据中两组间比较获得的DEGs进行随机选择,共选择10条开展荧光定量PCR(quantitative-real-time-PCR,qRT-PCR)验证,以判断在转录物组分析中的DEGs的可信度。根据所选DEGs的序列设计特异性引物(Table1),利用上述转录物组分析所用的原始厚壳贻贝外套膜组织的转录物组样本为模板,采用SYBR Green 荧光定量 PCR 试剂盒(Takara)和ABI 7500荧光定量PCR 系统(ABI 7500 Real Time PCR System,Applied Biosystems)。qPCR实验条件设置为95℃ 15 s,60℃ 30 s,循环40次。在 PCR 循环结束时,进行熔解曲线分析以确定扩增反应的特异性,并以18S-RNA 作为内参。基因表达量用2-ΔΔct方法进行计算。

1.5 贻贝外套膜组织的显微观察

取上述3组贻贝的外套膜组织,经4%多聚甲醛固定,再经石蜡包埋,使用切片机(HistoCore BIOCUT, Leica)进行切片,切片厚度为4 μm;切片使用乙醇进行梯度脱水和复水操作;采用Hematoxylin and eosin (H&E)染色技术对切片进行染色;染色后的切片使用光学显微镜(ECLIPSE E100, NIKON, Japan)进行观察,重点观察外套膜外褶皱部位的表皮细胞层。

1.6 统计学分析

分析数据以平均值±方差 (mean ±SD)记录,采用3次平行试验。利用统计分析软件SPSS 16.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA);采用最小显著差数法(Least Significant Difference,LSD)进行相关显著性检测;以P<0.05作为具有统计学意义的差异。

Table 1 Primers used for qRT-PCR to verify the differentially expressed transcripts from transcriptomic data

2 结果

2.1 厚壳贻贝外套膜转录物组测序质量较高

针对3组厚壳贻贝外套膜共9个平行样本构建了9个cDNA测序文库。经Illumina Novaseq 6000 平台测序,总计获得原始测序数据62.82 Gb,平均每个样本6.98 Gb;经去除低质量序列和接头序列,各文库测序所得干净阅读子(clean reads)总计407227922条,错误率低于0.03%,Q30值均大于91.5%,Q20值均大于96.9%(Table 2)。以上数据表明,测序质量符合后续分析要求。

进一步将测序所得干净阅读子定位到厚壳贻贝基因组,9个样本的总比对率为21.32% ～ 63.21%,唯一比对率为29.72% ～ 60.08%。在此基础上对阅读子进行组装,以厚壳贻贝基因组为参考基因组,经Trinity软件组装,共产生86 924个转录本,归属于44 898条单一基因(unigene)。所有组装好的转录本的长度分布正如Fig.1A所示,其中,长度大于1 800 bp的转录本所占比例最大,表明组装质量较高。对上述86 924条转录本进行注释分析,注释数据库分别为GO、KEGG、COG、NR、SWISS-PROT和Pfam数据库,以E值小于1×10-5为阈值,共有71 437条 (占比82.18%)转录本获得注释 (Fig.1B)。

Fig.1 The length distribution and the annotation statistics of assembled transcripts from the mantle transcriptome of M. coruscus (A) The length distribution of assembled transcripts. (B) Annotation statistics of the assembled mantle transcriptomic data

2.2 不同组间厚壳贻贝外套膜转录物组具有明显差异

通过RESM软件对各转录本进行表达量分析,采用TPM法计算所有转录本的表达量,所有转录本的表达量分布见Fig.2A。在此基础上根据各组样本的转录本表达量差异,采用PCA作图方式对3组样本进行相关性分析,PCA相关性二维图见Fig.2B。由图可见,3组样本在图中具有明显分离,表明不同处理条件导致各组样本的转录本表达量发生了明显差异。

Fig.2 Expression distribution of transcriptome and PCA diagram from 9 mantle samples of M. coruscus (A) Expression distribution of the mantle transcriptome from nine mantle samples; (B) PCA diagramof the mantle transcriptome from nine mantle samples.CN represents the mussels with complete shells and raised in normal sea-water(pH8.1); CA represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater (pH7.4)after urea injection

Table 2 Summery of the raw RNA sequencing data from 9 mantle samples of 3 mussel groups

进一步采用DESeq2软件和BH(Benjamini-Hochberg)多重检验校准法,对3组贻贝外套膜的转录物组数据进行两两比较,筛选出差异倍数大于2,且P<0.05的DEGs总计15 180条。其中,CAU 对比CN组共检测到DEGs 2 692条,包括上调基因1 062条和下调基因1 630条;CA对比CN组检测到DEGs 5 278条,包括上调基因2 321条和下调基因2 957条;CAU对比CA组检测到DEGs2 691条,含上调基因1 373条以及下调基因1 318条。上述组间DEGs的火山图见Fig.3。

Fig.3 Volcanomaps of differential expressed transcripts from three pairwise-comparisons of the mantle samples CN represents the mussels with complete shells and raised in normal seawater(pH8.1); CA represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater (pH7.4)after urea injection

2.3 不同组间的差异基因涉及多种生物学功能

对上述组间比较所得DEGs进行功能注释与富集分析。对DEGs的GO功能注释结果表明,多数差异基因主要集中在细胞过程(cellular process)、膜部分(membrane part)和结合(binding)条目(Fig.4A);对差异基因的KEGG注释结果表明,多数差异基因主要涉及信号转导(signal transduction)、癌总览(cancer: overview)、病毒感染(infectious disease: viral)、内分泌系统(endocrine system)、转运与代谢(transport and catabolism)等功能(Fig.4B)。

Fig.4 Functional annotation of differential expressed transcripts from three mantle groups of M. coruscus (A) GO functional annotation results; (B) KEGG functional annotation results

在差异基因功能注释结果基础上,进一步采用软件Goatools通过Fisher精确检验进行功能富集分析。以校正后P值小于 0.05作为显著富集依据,共筛选出具有显著GO功能富集的差异基因6 816条。其中,CA对比CN组(CAvs. CN)的差异基因有6 546条富集到GO功能112个条目,其中富集数量最多的20个GO条目列于Table 3;CAU对比CN组(CAUvs. CN)有84条差异基因富集于17个GO功能条目,CAU 对比CA组(CAUvs. CA)有186条差异基因富集于11个GO功能条目(Table 3)。

根据组间差异基因的GSEA分析结果,筛选P小于0.05且NES(normalized enrichment score)绝对值大于1的富集结果。依据NES绝对值对富集结果由高到低进行排序,富集程度最高的10个基因集列于Table 4。由表可见,CA组相比对照组(CN组),其差异基因集主要富集于tRNA相关代谢功能以及纤毛相关功能;而CAU组相比对照组(CN组),其差异基因集主要富集于氨基酸相关,以及自噬相关条目;此外,CAU组相比CA组,其差异基因集主要富集于核酸代谢,细胞分泌和物质运输,rRNA相关,以及ncRNA相关功能条目。从NES得分显示,CAU组对比CA组,其富集的基因集均为正值,表明尿素的添加对于贻贝外套在酸化条件下的核酸代谢,细胞分泌和物质运输,rRNA相关,以及ncRNA相关功能的通路出现上调或激活现象。

进一步对3组样本的差异基因进行KEGG功能富集分析,以P<0.05为筛选依据,结果表明,CAvs. CN组的差异基因有1 036条差异基因显著富集于29条KEGG通路,其中富集数量最多的3个通路为神经退行性疾病通路(pathways of neurodegeneration),肌萎缩侧索硬化通路(amyotrophic lateral sclerosis),以及细胞凋亡(apoptosis)通路;CAUvs. CN组有229条差异基因显著富集于9条KEGG通路,其中富集程度最高的3个通路为肌萎缩侧索硬化通路(amyotrophic lateral sclerosis),蛋白质内质网处理通路(protein processing in endoplasmic reticulum),以及铂类药物耐药性通路(platinum drug resistance);CAUvs. CA组有788条差异基因显著富集于52条KEGG通路,富集程度最高的3个通路为细胞凋亡(apoptosis),癌症通路(pathways in cancer),以及沙门氏菌感染通路(salmonella infection)。上述差异基因显著富集的KEGG通路气泡图见Fig.5。此外,发现共有19条KEGG通路被CAvs. CN组和CAUvs. CA组两个组间差异基因所共同富集;主要涉及疾病、免疫以及细胞功能相关的KEGG通路(Table 5)。通过分析每条共同富集通路的上调差异基因和下调差异基因的数量,发现CAvs. CN组的19条KEGG通路中,多数上调基因数量大于下调基因数量,表明上述通路在酸化条件下被激活;而在CAUvs. CA组中,富集于上述通路的上调差异基因数量则小于下调基因数量(Table 5),表明尿素添加对上述通路呈抑制效果。

Fig.5 Bubble diagrams of KEGG functional enrichment of differential expressed transcripts from the three pairwise-comparisons of the mantle sample from M. coruscus (A) KEGG functional enrichments of differential expressed transcripts from CA vs. CN comparison; (B) KEGG functional enrichments of differential expressed transcripts from CAU vs. CNcomparison; (C) KEGG functional enrichments of differential expressed transcripts from CAU vs. CAcomparison. CN represents the mussels with complete shells and raised in normal seawater(pH8.1); CA represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shells and raised in acidified seawater (pH7.4)after urea injection

2.4 酸化及尿素添加影响了外套膜中生物矿化相关基因的表达量

贝壳基质蛋白质(shell matrix proteins, SMPs)是贝类贝壳形成的关键蛋白质。为进一步探讨尿素添加是否影响到贻贝外套膜中SMPs的表达,依据此前研究中从厚壳贻贝贝壳中鉴定到的63种SMPs[27]对从本研究中差异基因进行筛选,总计筛选到9种SMP,共27条转录本,其在3组厚壳贻贝外套膜中的表达量(TPM值)列于Table 6。由表可见,酸化条件下,Nacrein,Lustrin,Regucalcin,以及Perlwapin的转录本呈上调趋势;而碳酸酐酶、酪氨酸酶以及Perlucin的转录本呈下调趋势;几丁质酶和几丁质合成酶则表现为不同转录本具有不同的响应特征,其中,几丁质酶7条转录本中,3条呈下调趋势,2条呈上调趋势;3条几丁质合成酶转录本中,2条呈现下调趋势,1条呈上调趋势(Table 6)。尿素添加对上述SMP在酸化条件下的表达量产生影响,诱导了Nacrein,Regucalcin,碳酸酐酶,酪氨酸酶,几丁质合成酶以及多数Perlucin转录本在酸化条件下的上调。同时,尿素添加诱导了Lustrin,Perlwapin,以及部分几丁质酶转录本的下调(Table 6)。

2.5 转录物组数据与荧光定量PCR数据一致

采用q-PCR技术对随机选择的10条转录物组测序所得差异基因(含5个上调差异基因和5个下调差异基因)进行表达量验证,以判断定量蛋白质组学研究结果的可靠性,以表达量差异倍数取对数作图,结果见Fig.6。由图可见,10条转录物组测序所得差异基因与qPCR验证结果均一致,表明本次研究转录物组测序结果可靠。

Fig.6 qRT-PCR verification of the expression level of 10 randomly selected differential expressed transcriptsfrom Illumina HisSeq Gene expression level was calculated by the TPM value for Illumina HisSeq and by 2-ΔΔct for qRT-PCR data, respectively. The logarithm of the target gene expression relative to that of the control group was plotted as the ordinate. The data were shown as mean ± SD (n=3)

2.6 不同条件下厚壳贻贝外套膜上皮层形态结构出现明显变化

贝类外套膜分为中央区和边缘区,其中边缘区被认为与贝壳形成有关[28]。此外,外套膜边缘区通常包含3个褶皱(fold),分别为外褶皱 (outer fold),中间褶皱(middle fold)和内褶皱(inner fold)[29]。其中,外褶皱部位被认为是与贝壳形成直接相关的组织[29]。对3组贻贝外套膜边缘区的外褶皱部位进行显微观察,采用HE染色方式,结果正如Fig.7所示。由图可见,与对照组(Fig.7A)相比,酸化处理诱导贻贝外套膜外褶皱上皮细胞层出现明显裂隙,蓝色细胞核区域出现明显下陷,且上皮细胞层表面的纤毛间距出现增大,细胞结构出现轻微破损现象(Fig.7B);而酸化条件下添加尿素后的贻贝外套膜,其外褶皱上皮细胞层虽也出现裂隙,但细胞表面结构相对完整,纤毛结构未出现明显变化;蓝色细胞核区也未出现明显下陷(Fig.7C)。

Fig.7 Hematoxylin and eosinstaining for the outer fold of mantle edge and micro-photos of the epithelial layer (A) the mantle sample from the CN group; (B) the mantle sample from the CA group; (C) the mantle sample from the CAU group. The scale bar is 100 μm; The nucleus was stained in blue and the cytoplasm was stained in pink. Black arrow denotes the epidermal cell layer and red arrow denotes the region of the nucleus

Table 3 GO functional enrichment of differential expressed transcripts from the three pairwise-comparisons of the mantle sample from M. coruscus

3 讨论

长江口海域是我国的厚壳贻贝主产区,受季节性冲淡水影响,该海域的pH值呈现剧烈的波动特征[30],特别是在夏季,甚至会出现短期7.2～7.6的pH低值[31]。因此,生存于该海域的厚壳贻贝必然具备适应短期pH值下降的能力。目前对于贻贝适应海洋酸化的分子机制尚不清晰。此前的研究已发现,厚壳贻贝组织中含有较高浓度的尿素,且厚壳贻贝组织中具有脲酶[19]。此外,有研究表明,海水酸化会导致贻贝组织中氨离子(NH4+)浓度的上升[32],且其来源为NH3的合成速率加快所导致[33, 34]。考虑到尿素可在脲酶的降解下产生NH3,且NH3在水中可转化为NH4+从而有助于提升局部环境的pH值。因此,贻贝体内所储存的尿素可能对贻贝对抗海洋酸化的不利影响具有重要贡献。为此,本文分析了贻贝在正常海水,酸化海水,以及添加尿素的情况下,其外套膜组织转录物组的变化,以期探讨尿素在贻贝对抗海洋酸化过程中的可能分子机制。

Table 6 Expression levels of biomineralization related transcripts from the three pairwise-comparisons of the mantle sample

本文首先注意到,PCA分析中,CA组与CN组之间的PC1距离较CAU组与CN组之间要大(Fig.2);相比CAUvs. CN组,CAvs. CN组所产生的差异基因数量较多(Fig.3),上述结果表明,酸化对贻贝外套膜转录物组的影响较大,且添加尿素有助于减少酸化对贻贝外套膜转录物组的影响。对差异基因的功能富集分析表明,酸化对贻贝外套膜主要影响到疾病相关通路以及信号传递相关通路等(Fig.5)。考虑到当前KEGG数据库所收集的通路主要来自人以及小鼠等模式哺乳动物,尚缺乏软体动物专有的KEGG功能数据库,因此,本研究中差异基因所富集的人类疾病相关代谢功能通路,预示着贻贝外套膜中可能具有类似的通路,但不一定是跟人类疾病有关,而可能与贻贝免疫过程或细胞增殖分化有关。

另外,CAvs. CN组差异基因所富集的部分KEGG通路与生物矿化存在关联,表明酸化可能对贻贝外套膜的生物矿化功能产生影响。例如,肌萎缩侧索硬化通路在小鼠成骨细胞分化中发挥了重要作用[35],在人体中,该通路与骨组织的形成与健康也存在关联[36];此外,破骨细胞分化通路(osteoclast differentiation)与人体骨组织形成具有重要关联[37];集管酸分泌(collecting duct acid secretion)通路已被证实在人体肾结石的形成中发挥了重要作用[38]。此外,与细胞稳态维持的相关KEGG通路,例如,细胞凋亡(apoptosis),溶酶体(lysosome)以及自噬(autophagy)在CAvs. CN组也被显著富集。上述KEGG通路与细胞完整性以及细胞动态平衡的维持有关。在环境胁迫条件下,以上通路被激活可用于清除损坏或死亡的细胞[39]。在GSEA分析中,酸化诱导了差异基因集富集于纤毛相关功能,且其NES得分为负值(Table 4),表明酸化对外套膜的纤毛相关功能产生了抑制。上述现象表明,酸化可能导致了贻贝外套膜上皮细胞以及纤毛层出现损伤,因此,诱导了上述通路的激活并以此清除或者修复损伤的细胞。值得注意的是,本研究对贻贝外套膜组织的显微观察表明,酸化会导致贻贝外套膜组织上皮细胞层出现明显的细胞破损以及纤毛间距增大等现象(Fig.7)。上述变化与观察到的细胞凋亡,自噬等相关通路的激活(Fig.5),以及纤毛相关功能的差异基因富集(Table 4)可能存在关联。同时,CAvs. CN组中,mTOR 信号通路(mTOR signaling pathway)被显著富集。mTOR信号通路被认为与细胞自噬的调节有关,该通路的激活有助于抑制细胞自噬[40]。本文推测,酸化导致贻贝外套膜细胞出现损伤诱导了mTOR 信号通路的激活,其用于在清除受损细胞的同时,维持细胞的稳态,防止出现自噬或凋亡过度的现象。

CAUvs. CN组差异基因主要富集于天冬氨酸代谢,RNA 编辑,细胞骨架以及大分子复合物等相关GO功能条目(Table 3);考虑到厚壳贻贝外套膜尿素循环过程中,天冬氨酸与瓜氨酸合成为精氨琥珀酸是其关键代谢反应之一[20],因此,尿素的添加可能对天冬氨酸代谢产生影响。KEGG富集结果表明,CAUvs. CN组的差异基因主要富集于药物代谢相关,免疫相关以及蛋白质合成与代谢相关通路。本文注意到,CAUvs. CN组差异基因所富集的KEGG通路远少于CAvs. CN组,且CAvs. CN组差异基因所富集的多数KEGG通路并未在CAUvs. CN组中得到富集,例如,细胞凋亡(apoptosis),溶酶体(lysosome),自噬(autophagy),以及与生物矿化具有潜在关联的通路等(Fig.5)。这表明酸化条件下添加尿素有助于减轻贻贝外套膜对酸化的敏感性,从而导致了差异基因数量的下降,也导致了所富集的KEGG通路的减少。对外套膜的显微观察中,与CA组相比,CAU组细胞结构稍显完整(Fig.7)。推测与尿素添加后逆转了酸化对外套膜细胞凋亡,自噬,溶酶体以及mTOR信号通路的抑制作用有关,从而减轻了外套膜组织细胞在酸化下的胁迫效应。

进一步对CAUvs. CA组差异基因进行分析,发现CAUvs.CA组差异基因在GO富集分析中主要富集于氧化还原平衡,固醇代谢,以及离子结合功能等相关的GO条目(Table 3)。此前已有研究发现,尿素在体外研究中会影响细胞色素C的铁硫中心簇结构[41],推测可能因此对细胞氧化还原功能产生影响。此外,尿素能抑制胆固醇酯转运蛋白的活性,从而抑制了固醇类物质的运输[42],表明尿素与固醇代谢存在潜在关联。KEGG富集分析表明,CAUvs. CA组差异基因主要富集于细胞过程、免疫、细胞信号转导等相关通路。在CAvs. CN组中,被激活的细胞凋亡、自噬、溶酶体以及mTOR信号通路在CAUvs. CA组中出现明显抑制现象(Table 5)。部分免疫相关通路,例如肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway),Toll与Imd信号通路(Toll and Imd signaling pathway),以及抗原处理及呈递通路(antigen processing and presentation)也具有类似现象。上述结果表明,在酸化条件下,尿素的添加抑制了酸化所诱导的KEGG通路的激活,从而减轻了酸化对外套膜组织的细胞过程以及免疫应激的胁迫影响。GSEA分析进一步证实,尿素添加对贻贝外套膜部分被酸化激活的功能条目的逆转,在CAvs.CN组中多数富集的功能条目其NES值为负值,而在CAUvs.CN 组中其NES值均为正值(Table 4),表明尿素的添加有助于激活贻贝外套膜中相关功能条目,从而在贻贝对抗酸化的过程中具有积极意义。

此外,酸化条件下,外套膜中生物矿化相关蛋白质,例如Nacrein,Lustrin,Regucalcin,以及Perlwapin的转录本表现为上调趋势(Table 6)。其中,Nacrein是一种含有碳酸酐酶结构域的SMP,在牡蛎中被认为与贝壳中方解石型碳酸钙晶体的形成有关[43];酸化通常会抑制Nacrein的表达并因此导致贝类贝壳的钙化率下降,例如在牡蛎和珍珠贝的研究中,发现酸化对2种贝类的Nacrein的表达均产生抑制效应[44, 45]。但在本研究中,厚壳贻贝外套膜的Nacrein表达量并未在酸化条件下出现下调,而是表现为上调。此前的研究也表明,pH值7.4的酸化条件并未影响贻贝贝壳的钙化率[46],推测酸化条件下,Nacrein的在贻贝外套膜组织中的上调有助于减轻酸化对贝壳钙化率的影响,也表明贻贝对酸化具有一定抗性。Lustrin是一种生物矿化相关的多功能蛋白质,主要分布于贝壳文石型碳酸钙晶体片层结构(珍珠质层)之间[47];在皱纹盘鲍中已发现,酸化会诱导Lustrin基因表达量的显著上调[48]。Regucalcin是一种钙结合蛋白质,对人骨组织钙离子调节以及骨组织稳态维持具有重要作用[49]。此前在厚壳贻贝贝壳中也鉴定到Regucalcin的存在,表明其参与了贻贝贝壳的生物矿化过程[27]。Perlwapin是一种生物矿化负调控蛋白质,在鲍鱼中已被证实能抑制碳酸钙晶体的形成[50]。本研究中,尿素的添加对Nacrein和Regucalcin转录本的上调,以及对Lustrin和Perlwapin的下调表明,尿素可能对上述SMP在酸化条件下的分子响应产生了正面影响,从而维持了其贝壳在酸化条件下的正常生物矿化过程。进一步分析尿素添加对酶类SMP分子的影响,包括酪氨酸酶,几丁质酶,几丁质合成酶以及碳酸酐酶。其中,酪氨酸酶在贻贝中与贝壳的发育有关[51];海洋酸化会对牡蛎幼虫贝壳发育阶段的酪氨酸酶产生抑制,并导致牡蛎幼虫体内多巴胺含量的上升[52]。几丁质酶与几丁质合成酶参与了贝壳中几丁质层的形成和代谢过程。此前在厚壳贻贝贝壳中已鉴定到2种酶的存在[27]。此外,在太平洋牡蛎中,已观察到海洋酸化会抑制几丁质合成酶的表达,同时上调了几丁质酶的表达量,表明酸化会导致贝壳中几丁质层的降解而对贝壳的正常发育产生不利影响[53]。碳酸酐酶是海洋矿化生物(例如珊瑚,贝类,螺类等)中与生物矿化过程具有重要关联的一类蛋白质,也因此成为检测海洋酸化对矿化生物影响的一类生物标记物[54]。此前的研究已表明,海洋酸化对不同物种的碳酸酐酶具有不同的影响。例如珊瑚和贻贝中,均发现碳酸酐酶的活力受酸化影响而出现下调[55],表明酸化对碳酸酐酶具有抑制作用;但是在牡蛎中发现,酸化会诱导其外套膜组织中的碳酸酐酶的基因表达量出现上调[56];推测碳酸酐酶可能因其存在不同的转录本且具有不同的功能所致。本研究发现,厚壳贻贝外套膜中3条碳酸酐酶的转录本均表现为酸化条件下的下调,以及添加尿素后的表达量上调(Table 6)。表明尿素添加可能对碳酸酐酶的不同转录本具有不同影响,后续值得进一步深入研究。

贻贝贝壳中还存在具有免疫功能的SMP。例如,Perlucin是一种含凝集素结构域的SMP,被认为与贝壳珍珠质层碳酸钙晶体的形成有关[57, 58];在牡蛎中发现,封闭Perlucin基因的表达会导致牡蛎幼虫在酸化条件下出现壳发育异常[59]。上述结果表明,Perlucin在贝类酸化条件下生物矿化过程具有重要作用。本文发现,酸化可诱导贻贝外套膜中多数perlucin的转录本表达量出现下调,尿素添加则对其中部分perlucin的表达量出现上调影响,这表明尿素的添加对受酸化抑制的perlucin基因具有恢复作用。

综上所述,酸化会对贻贝外套膜转录物组的影响主要涉及细胞稳态、免疫调节和生物矿化等多方面,而尿素的添加会抑制部分受酸化所激活的代谢通路,包括细胞稳态维持和免疫调节等相关通路(Fig.8);同时,尿素添加还诱导了部分收酸化抑制的SMP的表达量上调。虽然目前尚不清楚尿素通过何种机制诱导了外套膜中部分SMP基因的上调,但已知尿素经脲酶降解产生碳酸根离子和氨离子,氨离子有助于在组织中形成局部的碱性环境,从而对抗酸化带来的pH值的下降;此外,尿素降解产生的碳酸根离子也对贻贝贝壳的生物矿化提供了额外的内源性碳酸根离子用以形成碳酸钙。因此,尿素的添加有助于减轻酸化对外套膜生物矿化相关功能的不利影响,提升贻贝对海洋酸化的耐受性。

Fig.8 Schematic view of the effects of acute acidification and urea supplementation on the mussel mantle Ctrl represents control group; CA represents the mussels with complete shell and raised in acidified sea-water(pH7.4); CAU represents the mussels with complete shell and raised in acidified sea-water (pH7.4)after urea injection