丝裂原活化蛋白激酶15纳米抗体的制备及其在B16-F10黑素瘤细胞生长过程中的抑制作用

贾 琼, 金聪俐, 胡世雄, 秦蓉芬, 赵立峰, 范瑞文*

(1)山西农业大学动物医学学院, 山西, 晋中 030801;2)天津市北辰区农业发展服务中心, 天津 300400)

丝裂原活化蛋白激酶15 (mitogen-activated protein kinase 15,MAPK15),又称ERK7或ERK8,最早由Abe等人于1999年在大鼠中发现[1],是MAPK家族非典型的新成员。MAPK15参加多种细胞活动,例如促进细胞增殖、细胞转化和凋亡[2];刺激自噬、调节细胞分裂、纤毛发生和蛋白质分泌;维持基因的稳定性等[2]。目前,尚不清楚MAPK15属于原癌基因还是肿瘤抑制基因。在胃癌中,MAPK15的过表达能够通过延长c-Jun的稳定性来促进胃黏膜的恶性转化[3];在骨肉瘤中,MAPK15被认为是转移相关基因,并通过c-Jun/MMP通路促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[4]。MAPK15过表达能够通过自噬途径促进男性生殖细胞的恶性转化,能够防止DNA损伤和肿瘤抑制因子肿瘤蛋白P53(tumor protein p53,TP53)的激活[5]。由于MAPK15在不同肿瘤中的过表达和扩增,MAPK15值得作为药物靶点进行探索。

纳米抗体,也被称为重链抗体可变区(variable domain of heavy-chain of heavy-chain antibody, VHH)或单域抗体,是一种独特的和功能性重链抗体[6]。与常规抗体不同,纳米抗体是仅由重链可变区组成的独特抗体片段。纳米抗体的分子量仅有15 kD,是常规抗体的1/10,抗原结合力与常规抗体相似,但溶解度更高,稳定性好,在识别和结合方面具有独特的优势[7]。近年来,纳米抗体逐步被认为是常规单克隆抗体的替代品,结合CAT-T疗法也给免疫肿瘤治疗带来了飞跃性的改变,在肿瘤治疗领域方面具有巨大的潜能。因此,纳米抗体在生物研究、医学诊断、免疫治疗等生物医药领域应用越来越广泛。

黑色素瘤是死亡率较高的皮肤癌类型,起源于黑色素细胞的恶化[8]。黑色素细胞起源于神经外胚层,但是能广泛迁移至全身。由于黑色素细胞分布广泛,人和哺乳动物全身各个器官组织均有可能发生黑色素瘤。因此,抗黑色素瘤药物的开发迫在眉睫。本研究选择MAPK15为药物靶点,筛选特异性的MAPK15纳米抗体,并探究该纳米抗体在B16-F10黑色素瘤细胞中的作用,以期为后续黑色素瘤的治疗及药物开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

B16-F10黑色素瘤细胞纳米抗体文库、大肠杆菌TG1、KM13噬菌体、pColdⅠ载体、B16-F10细胞均由本室保存,MAPK15多肽(义翘神州)、质粒小提中量试剂盒(天根)、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪),SDS-PAGE凝胶试剂盒(索莱宝)、蛋白质标记物(marker)(赛默飞)、鼠抗HIS-HRP单克隆抗体(三鹰)、荧光定量PCR试剂盒(诺唯赞)、CCK8试剂盒(翊圣生物)、HPR-抗M13噬菌体抗体(义翘神州)、酶标板(NEST)、TMB单组份显色液、ELISA终止液(索莱宝)、镍柱(Cytiva)。

1.2 MAPK15-VHH的筛选和鉴定

用20 μg/mL的MAPK15多肽包被免疫管,4 ℃过夜后用MPBS (PBS+2.5%脱脂奶粉)室温封闭2 h。将过夜复苏的B16-F10黑色素瘤细胞纳米抗体文库用PEG-NaCl沉淀噬菌体,将噬菌体用MPBS孵育1 h。将封闭的噬菌体加入至封闭的免疫管,37 ℃孵育2 h,再用PBST洗管10次,此后再用PBS洗管10次。使用2 mL 100 mmol/L三乙醇胺溶液洗脱噬菌体,再加入2 mL Tris-HCl(1 mol/L, pH=7.4)中和。将洗脱的噬菌体转移至16 mLA400=0.4 TG1菌液,37 ℃水浴30 min。噬菌体侵染TG1菌液后离心,用2YT培养基重悬菌体并涂布于2YTAG固体培养板,30 ℃过夜培养。次日将固体板上的菌落收集并加入15%甘油,命名为一级文库菌,-80 ℃保存。经过4轮筛选,从四级文库菌培养板上挑取192个单克隆,将其转到2块96深孔板,30 ℃振荡培养。将过夜培养的菌液转接到2块新96深孔板中,37 ℃振荡培养,剩余的菌液加入15%甘油保菌。转接96深孔板加入KM13辅助噬菌体,过夜培养使噬菌体释放至上清,将噬菌体与封闭液共同孵育1 h,在MAPK15多肽包被的酶标板中加入封闭液处理过的噬菌体上清,使其进行特异性结合,再孵育偶联HRP的抗M13噬菌体抗体作为二抗进行亲和鉴定筛选。对ELISA结果进行分析,以P/N≥3的克隆为阳性,选择阳性反应较强的菌株进行测序,获得序列,并将该纳米抗体命名为MAPK15-VHH。

1.3 MAPK15-VHH的制备及鉴定

根据测序获得的VHH序列设计克隆引物VHH-F、VHH-R(Table 1)进行扩增,以BamH Ⅰ和XbaⅠ酶切位点插入pCold Ⅰ(含His标签)原核表达载体,构建MAPK15-VHH重组质粒并测序。将测序正确的重组质粒转化入BL21(DE3)菌株,并优化IPTG浓度、诱导温度及转速等条件。按照优化的条件大量表达MAPK15-VHH,通过AKTA pure系统进行纯化并对纯化后的MAPK15-VHH进行SDS-PAGE鉴定。

1.4 MAPK15-VHH与MAPK15多肽亲和力检测

用竞争ELISA方法检测MAPK15-VHH与MAPK15多肽的亲和力。用MAPK15多肽以2 μg/mL浓度,100 μL/孔,4 ℃过夜包被酶标板。次日弃掉板内液体,加3%BSA封闭液于37 ℃封闭1 h。将MAPK15多肽进行一系列梯度稀释(1.5-1～1.5-18),初始浓度为40 nmol/L。将50 μL 各梯度稀释液与50 μL MAPK15-VHH(0.01 mg/mL)混合,37 ℃孵育30 min,作为ELISA检测中的一抗。待酶标板封闭结束,弃去板内液体,将提前处理好的一抗加入酶标板中,37 ℃孵育1 h。一抗孵育结束,弃去板内液体,用PBST(PBS+0.05% Tween 20)洗板10次,加入稀释后的鼠抗HIS-HRP单克隆抗体(1∶15 000)于37 ℃孵育1 h。孵育结束,PBST洗板10次后用TMB显色15 min,用ELISA终止液终止显色,最后用多功能酶标仪读取450 nm吸光值。

Table 1 Primer Sequence

1.5 MAPK15-VHH检测脑组织中丝裂原活化蛋白激酶15的表达

分别以正常小鼠脑组织蛋白质进行蛋白质印迹(Western blotting)检测,以及正常小鼠脑组织石蜡切片进行免疫组织化学分析,以纯化得到的MAPK15-VHH蛋白作为一抗,以鼠抗HIS-HRP作为二抗,从而检测其中MAPK15在蛋白质水平的表达量及定位情况。

1.6 MAPK15-VHH对B16-F10细胞增殖影响

将B16-F10细胞培养至对数生长期,过表达MAPK15 12 h,将细胞消化离心并重新接种于96孔板内2 000个/孔,待细胞贴壁后向细胞内分别添加不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL)的MAPK15-VHH,每孔添加CCK8 10 μL,从而确定MAPK15-VHH最佳作用浓度。

在过表达MAPK15的细胞中添加80 μg/mL MAPK15-VHH,作用24 h后收集细胞分别提取RNA和蛋白质进行后续检测。以RNA逆转录的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR(qPCR),(引物见Table 1)检测CREB、ERK、MEK1、MNK1的表达量。同时通过Western 印迹检测以上基因在蛋白质水平的表达量,以确定MAPK15-VHH对B16-F10细胞增殖的影响。

1.7 MAPK15-VHH对B16-F10细胞自噬的影响

利用提取的RNA和蛋白质分别进行实时荧光定量PCR和Western 印迹检测自噬相关基因PI3K、AKT、mTOR和LC3B的表达情况(引物见Table 1),以确定MAPK15-VHH对B16-F10细胞自噬的影响。

1.8 数据统计分析

本实验中涉及Western印迹结果用Image Lab 6.0软件进行灰度值分析,实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行多组间两两比较,采用LSD-t检验进行分析,其中双侧P<0.05有统计学意义。*P<0.05表明差异显著,**P<0.01和***P<0.001代表差异极显著。

2 结果

2.1 MAPK15-VHH的筛选和鉴定

以MAPK15多肽对B16-F10黑色素瘤细胞纳米抗体文库进行4轮筛选,第4轮筛选结束随即挑选192个单克隆进行ELISA鉴定,鉴定结果表明,MAPK15纳米抗体筛选以A450>2.2为阳性克隆,共有75个克隆(Fig.1A)。

Fig.1 Screening, preparation, and identification of MAPK15-VHH (A) The affinity of the phage supernatant to MAPK15 polypeptide was determined by ELISA, and A450>2.2 was identified as a positive clone. (B) The BLAST result of the sequence of MAPK15-VHH recombinant plasmids and the reference to verify the accuracy of MAPK15-VHH. (C) Optimization conditions of MAPK15-VHH induced expression: the IPTG concentrations of 1 nmol/L, 0.8 nmol/L, 0.6 nmol/L, 0.4 nmol/L, 0.2 nmol/L, 0.1 nmol/L, 0 nmol/L respectively; Temperature of 15, 20, 28, and 37℃ respectively; speed of 200, 150, 100, and 50 r/min respectively; (D) The identification of MAPK15-VHH by SDS-PAGE with the band size of 15 kD

2.2 MAPK15-VHH的制备及鉴定

将阳性反应较强的克隆菌复苏,将菌液送上海生工测序。根据测序结果设计引物,构建MAPK15-VHH重组质粒并测序,测序结果比对正确(Fig.1B)。将正确的重组质粒转化BL21(DE3)菌,进行优化诱导表达条件,结果显示,添加0.6 nmol/L IPTG,在15 ℃ 经100 r/min 过夜诱导MAPK15-VHH表达量最高(Fig.1C)。通过Ni-NTA进行亲和层析,将纯化好的MAPK15-VHH进行SDS-PAGE电泳进行鉴定,结果显示,其电泳条带大小约15 kD(Fig.1D),与纳米抗体预期相符合。

2.3 MAPK15-VHH对丝裂原活化蛋白激酶15多肽亲和力检测

通过竞争ELISA法检测MAPK15-VHH与MAPK15多肽的亲和力,制作A450值分别与MAPK15-VHH浓度和log[MAPK15-VHH浓度]的拟合曲线,结果显示,拟合曲线内基本每个点均在曲线上或者两侧,曲线的R2=0.9976,说明该曲线拟合良好。该曲线表明,制备的MAPK15-VHH抗体亲和力KD=0.9829 (Fig.2A, B) 。

Fig.2 Measurement of the affinity of MAPK15-VHH to MAPK15 peptides (A) Fitting curve of A450 and MAPK15-VHH concentrations. (B) Fitting curve of A450 and log [MAPK15 VHH concentration]

2.4 MAPK15-VHH检测脑组织中丝裂原活化蛋白激酶15的表达

通过MAPK15-VHH对正常小鼠脑组织中MAPK15的检测,其结果正如Fig.3所示,Western印迹检测在60 kD附近有明显且单一的条带(Fig.3A);在免疫组织化学检测可以观察到,脑组织切片可以观察到细胞质中有强烈阳性反应(Fig.3B),说明MAPK15-VHH与组织中的MAPK15有较好的亲和性。

Fig.3 The detection of MAPK15 expression by MAPK15-VHH in brain tissues (A) MAPK15-VHH was used as the primary antibody in Western blotting to detect the protein level of MAPK15 in brain tissues of three wild-type mice. (B) MAPK15-VHH was used as the primary antibody in immunohistochemistry to detect the distribution of MAPK15 in brain tissues of three wild-type mice. PBS was used as the primary antibody in the NC group. The images were observed under 200× microscope

2.5 MAPK15-VHH抑制B16-F10细胞的增殖

在过表达MAPK15的B16-F10细胞中添加不同浓度的MAPK15-VHH,通过CCK8检测,结果表明,添加浓度为80 μg/mL 和100 μg/mL MAPK15-VHH对B16-F10细胞增殖抑制效果最明显,但将80 μg/mL 与100 μg/mL MAPK15-VHH的作用效果进行统计学分析,结果没有显著性差异,因此将80 μg/mL MAPK15-VHH视为最佳添加浓度(Fig.4A)。

Fig.4 MAPK15-VHH inhibited the proliferation of B16-F10 cells (A) Add 0, 20, 40, 60, 80, and 100 μg/mL MAPK15-VHH in the medium of B16-F10 cells overexpressing MAPK15, and cell proliferation was detected through CCK8 to determine the optimal concentration of MAPK15-VHH. (B) The mRNA expression of CREB, ERK, MEK1, and MNK1 proliferation-related genes in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC groups by qPCR. (C-D) Protein levels of CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, MEK1, p-MEK1, and MNK1 proliferation-related genes in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC by Western Blotting. In the quantitation, the protein level was analyzed by being normalized to β-actin, and the phosphorylated protein by being normalized to the total protein. MAPK15-OE represented the overexpression of MAPK15 in B16-F10 cells, MAP15-OE+VHH represented the addition of MAPK15-VHH in the medium of B16-F10 cells overexpressing MAPK15, and NC represented the wild-type B16-F10 cells. Data were presented as mean ± SD of the relative fold changes (n=3). *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001

对未添加、添加MAPK15-VHH和正常B16-F10细胞中CREB、ERK、MEK1、MNK1等增殖相关基因在mRNA水平的表达量进行检测,结果显示,与正常细胞相比,过表达MAPK15后CREB、ERK、MEK1、MNK1表达量分别增加67%、53%、86%和84%,且差异极显著(P<0.001)。在过表达MAPK15的细胞中添加MAPK15-VHH,与NC组相比,CREB、ERK、MEK1、MNK1的表达量分别增加37%、30%、41%和33%,且差异极显著(P<0.001);与仅过表达MAPK15的细胞相比,CREB、ERK、MEK1、MNK1表达量分别下降了17%、15%、24%、28%(Fig.4B)。

同样,过表达MAPK15时对p-CREB、CREB、p-ERK、ERK、p-MEK1、MEK1、MNK1蛋白质水平的表达量检测,结果发现,与正常细胞相比,这些增殖相关基因的蛋白质水平的表达量增加幅度均在80%以上,差异极显著(P<0.001)。在添加MAPK15-VHH后,与正常细胞相比,p-CREB、CREB、p-ERK、ERK、p-MEK1、MEK1、MNK1这些增殖相关基因蛋白质水平的表达量分别增加了78%、92%、47%、66%、76%、93%、61%,差异极显著(P<0.001);与仅过表达MAPK15的细胞相比,p-CREB的表达量下降了8%、p-ERK的表达量下降了22%、p-MEK1的表达量下降了9%,MNK1的表达量下降18%,但是CREB、MEK1的表达量变化仅1%(Fig.4C, D)。

2.6 MAPK15-VHH抑制B16-F10细胞的自噬

为探究MAPK15-VHH对B16-F10细胞自噬的影响,对未添加、添加MAPK15-VHH和正常B16-F10细胞中PI3K、AKT、mTOR、LC3B等自噬相关基因在mRNA水平表达量检测,结果显示,过表达MAPK15时PI3K、AKT、mTOR的表达量显著降低(P<0.001),分别是正常细胞的42%、38%、35%,但是LC3B的表达量显著升高(P<0.001),是正常细胞的1.48倍。添加MAPK15-VHH后,PI3K、AKT、mTOR表达量分别是正常细胞的60%、53%、58%倍,LC3B的表达量却只有1.26倍;与仅过表达MAPK15的细胞相比较,PI3K、AKT、mTOR表达量分别增加43%,39%,65%,LC3B的表达量减少了15%(Fig.5A)。

Fig.5 MAPK15-VHH inhibited autophagy in B16-F10 cells (A) The mRNA expression levels of autophagy-related genes (PI3K, AKT, mTOR, and LC3B) in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC by qPCR (normalized to actin). (B-C) Protein levels of PI3K, p-AKT, AKT, mTOR and LC3B in MAPK15-OE, MAP15-OE+VHH, and NC groups by Western blotting. In the quantitation analysis, the protein level was analyzed by being normalized to β-actin, and the phosphorylated protein by being normalized to the total protein. MAPK15-OE represented the overexpression of MAPK15 in B16-F10 cells, MAP15-OE+VHH represented the addition of MAPK15-VHH in the medium of B16-F10 cells overexpressing MAPK15, and NC represented the wild-type B16-F10 cells. Data were presented as mean ± SD of the relative fold changes (n=3). *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

过表达MAPK15时对PI3K、p-AKT、AKT、mTOR蛋白质水平的表达量进行检测,结果发现,PI3K、p-AKT、AKT、mTOR分别是正常细胞的43%、28%、83%和60%,差异极显著(P<0.001),LC3B的表达量是正常细胞的1.41倍(P<0.001);添加MAPK15-VHH后,PI3K、p-AKT、AKT、mTOR分别是正常细胞的55%、60%、93%、92%(P<0.05或P<0.001),而LC3B的表达量为正常细胞的1.27倍(P<0.01);与仅过表达MAPK15的细胞相比较,PI3K、p-AKT、AKT、mTOR分别增加了27%、114%、12%、53%,而LC3B的表达量降低了10%(Fig.5B、5C)。

3 讨论

纳米抗体来源于驼科重链抗体的可变区,是自然界中已知的最小的功能性抗体片段,其分子量约为15 kD[6]。本研究得到了MAPK15-VHH单克隆,KD值为0.9829,说明该抗体具有较高的亲和力;本文选择正常小鼠的脑组织蛋白质和石蜡切片,以MAPK15-VHH为抗体,可以有效的检测出组织中MAPK15的分布;MAPK15-VHH应用于Western 印迹,灵敏度较高,背景干净,条带单一。因此,本文筛选获得的MAPK15纳米抗体具有较高的亲和性,同时提示可以作为科研抗体,应用于MAPK15的功能研究。

MAPK15是MAP激酶家族中最后1个被发现的成员[16],在大鼠睾丸、肝、大脑、胰腺、肌肉和人的肺、肾、乳房、大脑、胸腺、心血管等多个组织中均可以检测到MAPK15 mRNA和蛋白质水平的表达[16-18]。近期有研究表明,MAPK15的活性和过表达受人类致癌基因调控[3],分别与人结肠癌细胞的转化[19]和人胃癌细胞的拷贝数增加有关[20,21],同时它也控制几个核受体的活性[17,18]。在增殖细胞中,MAPK15在维持核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的稳定性过程中所必需,是维持基因组完整性必需的[22]。此外,MAPK15强烈影响端粒酶活性,使该激酶在避开复制衰老和永生细胞的机制中发挥重要作用[23]。本文在B16-F10细胞中过表达MAPK15后,上调ERK、MEK1、MNK1、CREB的表达量,促进黑色素瘤细胞的增殖。随后在过表达MAPK15的黑色素瘤细胞中添加80 μg/mL MAPK15-VHH,发现以上细胞增殖相关基因的表达量显著减少,说明本文筛选获得的MAPK15纳米抗体可以靶向MAPK15,并达到抑制细胞增殖的效果。

MAPK15也是自噬的有效调节因子,在缺乏MAPK15的情况下,基础自噬和饥饿诱导的自噬都明显受到影响[24]。MAPK15是血清和氨基酸饥饿诱导的关键激酶。在饥饿诱导条件下,细胞的自噬反应增加并抑制相关蛋白质分泌[25]。近期有文献报道,MAPK15介导BCR-ABL诱导的自噬,并调节癌基因依赖的细胞增殖和肿瘤形成。MAPK15属于自噬标志物LC3B的上游调节剂,其与LC3B协同刺激细胞自噬过程[21-23]。本文探究了MAPK15纳米抗体是否能通过MAPK15对B16-F10细胞的自噬产生影响。在B16-F10细胞内过表达MAPK15时发现,LC3B的表达量有了显著的升高,但是在MAPK15-VHH的作用下,LC3B的表达又显著降低,这表明MAPK15-VHH能够抑制自噬囊泡对LC3B的募集,因而抑制B16-F10细胞的自噬过程。PI3K/AKT/mTOR信号通路是学者们认可的抑制自噬启动和调节的经典途径[26],本文通过检测PI3K、p-AKT、mTOR的表达量,在初期过表达MAPK15后发现,这些基因在mRNA和蛋白质水平表达量均显著升高,在添加MAPK15-VHH后又有明显的降低。然而,PI3K、AKT、mTOR也会影响细胞增殖,对于这部分情况本研究中并未探讨,这也是本研究的不足之处。

综上所述,恶性增殖和失衡的自噬是黑色素瘤的重要特征,MAPK15-VHH能够作为MAPK15的抑制剂,添加到过表达MAPK15的B16-F10细胞时,显著地抑制该细胞的增殖以及自噬。因此,MAPK15-VHH可作为抗黑色素瘤的潜在药物,为黑色素瘤的治疗提供新思路。

本研究成功的筛选得到1株亲和力较强的MAPK15纳米抗体,可作为Western印迹及免疫组织化学实验中的一抗,用于检测MAPK15在蛋白质水平的表达及分布;此外,该MAPK15纳米抗体可以作为MAPK15拮抗剂,有效地抑制B16-F10细胞的增殖和自噬进程,为临床检测试剂和治疗药物的开发提供理论基础。