基于响应面法优化柑白兰地原料酒发酵工艺

胡典纶，余 佶，刘圆圆，麻成金

（吉首大学 食药两用资源研究与高值化利用湖南省重点实验室，湖南吉首 416000）

椪柑（Citrus reticulata 'Ponkan'），芸香科柑橘属木本植物果实，原产浙江、湖南等省，现广泛分布于我国南方地区[1]。我国椪柑资源十分丰富[2]，椪柑果实出汁率高，富含维C、胡萝卜素、膳食纤维、矿物质等多种成分，具有抗衰老、预防心血管疾病、健脾胃等功效[3]，通常用来鲜食，部分经加工成果汁、果醋及果酒等产品形式[4-5]。然而，由于椪柑产业化加工技术研究不够，使得椪柑资源难以得到高值化利用而造成浪费。

白兰地是指将葡萄或其他水果，经发酵、蒸馏、陈酿及调配而成的蒸馏酒；目前，白兰地原料呈现多元化[6]，但暂时没有以椪柑为原料。研究利用椪柑汁进行酒精发酵，采用响应面法优化椪柑白兰地原料酒的发酵工艺条件，制备椪柑白兰地原料酒，为椪柑白兰地精深加工提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椪柑鲜果，吉首市优质椪柑基地提供；果酒专用酵母（RW）、生香活性干酵母；果胶酶（20 000 U/g）、橙皮苷酶、柚苷酶；碳酸氢钠（AR）；蔗糖、柠檬酸，均为食品级。

1.2 仪器与设备

Y966 型多功能榨汁机，上海九阳股份有限公司产品；TDL-40B 型台式离心机，上海安享科学仪器厂产品；JA-5103N 型高精度电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司产品；PHS-25 数字式pH 计，上海雷磁仪厂产品；WYT-J 型手持糖度计，成都光学厂产品；DK-S28 型电热恒温水浴锅，上海精其仪器有限公司产品；10-20 型精密酒精计，上海医用仪表厂产品；BSP-250 型生化培养箱，上海博迅医疗生物仪器厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程[7]

椪柑鲜果→分选清洗→去皮→榨汁→酶解→离心分离→调节糖酸度→接种酵母→酒精发酵→过滤→椪柑白兰地原酒→蒸馏→橡木桶贮藏陈酿→椪柑白兰地。

1.3.2 操作要点

（1）原料筛选与预处理。选用成熟优质椪柑鲜果，清洗后去皮，果肉进行榨汁，制备果浆。

（2）酶解。添加果胶酶40 mg/L，橙皮苷酶0.3 g/L，柚苷酶0.5 g/L，搅拌均匀，于40 ℃水浴中酶解120 min。将酶解后果浆以转速4 000 r/min 离心10 min，150 目滤布过滤，果汁备用。

（3）调节糖酸度。使用化学法降酸，向果汁中加入碳酸钠，通过添加蔗糖的方式进行初始含糖量的调节，调整糖度为12%～26%，调整果汁pH 值为3.5～5.5。

（4）接种酵母。将一定量的果酒酵母、生香活性干酵母（质量比2∶1）用10 倍质量分数5%葡萄糖水溶液进行溶解，于35 ℃条件下复水活化40 min，倒入椪柑果汁中混匀，将接种完成后的果汁转入发酵罐内。

（5）酒精发酵。将接种后的椪柑果汁在恒温和密封的条件下进行酒精发酵，定时测定糖度、酒精度，观察发酵液表面变化情况，以保证发酵正常进行，当发酵液残糖小于4 g/L 时可结束发酵，进入椪柑白兰地加工的陈酿和蒸馏工序。

1.3.3 单因素试验

（1）初始糖度。选取酵母添加量0.2%，发酵温度25 ℃，发酵时间7 d，发酵液pH 值4.0，探讨初始糖度（12%，14%，16%，18%，20%，22%，24%，26%，28%）对酒精发酵效果的影响。

（2）酵母添加量。选取初始糖度20%，发酵温度25 ℃，发酵时间7 d，发酵液pH 值4.0，探讨酵母添加量（0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%，0.40%）对酒精发酵效果的影响。

（3）发酵时间。选取初始糖度20%，酵母添加量0.2%，发酵温度25 ℃，发酵液pH 值4.0，探讨发酵时间（4，5，6，7，8，9，10 d）对酒精发酵效果的影响。

（4）发酵温度。选取初始糖度20%，酵母添加量0.2%，发酵时间7 d，发酵液pH 值4.0，探讨发酵温度（18，20，22，24，26，28，30，32 ℃）对酒精发酵效果的影响。

（5）发酵液pH 值。选取初始糖度20%，发酵时间7 d，发酵温度25 ℃、酵母添加量0.2%，探讨发酵液pH 值（3.5，3.8，4.1，4.4，4.7，5.0，5.3）对酒精发酵效果的影响。

1.3.4 响应面优化试验

根据Box-behnken 中心试验设计原理[8-9]和单因素试验结果，以酵母添加量、初始糖度、发酵温度为考查因素，酒精度为响应值，设计三因素三水平优化试验，探究各因素及其交互作用对椪柑白兰地原料酒发酵效果的影响，最终进行验证试验并确定最优发酵工艺条件。试验重复3 次。

试验因素与水平设计见表1。

表1 试验因素与水平设计

1.3.5 理化指标检测

酒精度测定采用酒精计法；残糖含量测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；pH 值测定采用酸度计法；糖度测定采用折光计检测法。重复测定3 次，取平均值。

1.3.6 数据分析

试验设计与数据处理采用Design Expert 8.0.6，绘图采用Origin 2021。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵温度的影响

发酵温度对酒精度和残糖含量的影响见图1。

图1 发酵温度对酒精度和残糖含量的影响

由图1 可知，随着发酵温度的升高，残糖含量呈先下降后上升的趋势，酒精度呈先上升后稍有下降的趋势；当发酵温度为24 ℃时，残糖含量达最低值2.18 g/L，酒精度达最高值11.65%Vol。发酵温度高低与酵母菌生长繁殖关系密切，过低的温度会抑制酵母菌活性，减缓糖降解过程，导致发酵结束时间延迟且不充分；过高的温度会加快酵母菌生长繁殖，消耗的糖分不能充分转化为酒精，发酵不充分，残糖量偏高，并且酵母由生长对数期提前进入稳定期，发酵结束时间较早，酒精度偏低[10]。为保证原料酒的发酵效果，选择发酵温度控制范围22～26 ℃。

2.1.2 初始糖度的影响

初始糖度对酒精度和残糖含量的影响见图2。

图2 初始糖度对酒精度和残糖含量的影响

由图2 可知，随着初始糖度增大，残糖含量持续上升，酒精度呈先上升后下降的趋势。当初始糖度≤22%时，残糖含量升高平缓，酒精度大幅度升高；当初始糖度为22%～26%时，残糖含量大幅度升高，酒精度达到最大值12.85%Vol，推测发酵接近完全；当初始糖度＞26%时，残糖含量继续升高，酒精度开始降低。原因可能是初始糖度过低，酵母没有足够的糖分来转换成酒精，则酒精度低；过高的初始糖度会增加发酵液的渗透压，抑制酵母菌发酵，导致残糖量高、酒精度低[11]。此外，较高的糖度容易引发微生物污染[12]，从而对原料酒品质产生不良影响，故选取初始糖度20%～24%。

2.1.3 酵母添加量的影响

酵母添加量对酒精度和残糖含量的影响见图3。

图3 酵母添加量对酒精度和残糖含量的影响

由图3 可知，随着酵母添加量增大，残糖含量持续下降，酒精度呈先上升后下降的趋势；当酵母添加量≥0.20%时，残糖含量趋于稳定，酒精度达到最大值11.6%Vol 后开始缓慢降低。根据有关文献报道，在一定范围内，酵母添加量越大，发酵越充分，进而残糖量越低、酒精度越高[13]；酵母添加量过高会加快酵母菌自身的呼吸和繁殖，过度消耗营养物质，不利于酒精生成，导致残糖量和酒精度降低[14]。综合考量，酵母添加量为0.15%～0.25%。

2.1.4 发酵时间的影响

发酵时间对酒精度和残糖含量的影响见图4。

图4 发酵时间对酒精度和残糖含量的影响

由图4 可知，随着发酵时间延长，残糖量先大幅度下降、后平缓下降，酒精度快速上升后趋于平稳；发酵时间＞7 d 时，残糖含量和酒精度变化不明显；发酵时间为8 d 时，酒精度达最大值11.54%Vol。若发酵时间偏短，酵母菌未充分利用糖分，导致发酵不彻底，造成原料酒的残糖量高、酒精度低，而当发酵彻底时，酒精度则趋于平稳状态[15]。考虑到实际生产效率，发酵时间选择7 d。

2.1.5 发酵液pH 值的影响

发酵液pH 值对酒精度和残糖含量的影响见图5。

图5 发酵液pH 值对酒精度和残糖含量的影响

由图5 可知，随着发酵液pH 值增大，残糖含量先下降后趋于平稳，酒精度呈先上升后下降的趋势；当发酵液pH 值4.1 时，酒精度达最大值11.62%Vol。相关研究表明，较低发酵液pH 值会严重抑制酵母菌，使得发酵减缓，导致残糖量高且酒精度低，而较大发酵液pH 值对于杂菌的抑制效果减弱，造成原料酒的品质下降为劣质[16]。因此，选择发酵液pH 值4.1 左右为宜。

综上，椪柑白兰地原料酒的适宜发酵温度22～26 ℃，初始糖度20%～24%，酵母添加量0.15%～0.25%，发酵时间7 d，发酵液pH 值4.1。

2.2 响应面优化试验

2.2.1 试验设计方案与结果

基于上述单因素试验结果，选取初始糖度、酵母添加量、发酵温度因素进行Box-behnken 试验设计，以酒精度为响应值。

响应面优化试验设计方案及结果见表2。

表2 响应面优化试验设计方案及结果

2.2.2 建立回归模型和方差分析

方差分析及显著性检验结果见表3。

表3 方差分析及显著性检验

使用Design Expert 对表2 中的响应值进行分析，建立回归方程预测模型：

由表3 可知，该回归模型极显著（p＜0.000 1），能较好反映椪柑白兰地原料酒的酒精度与各影响因素之间的线性关系（R2=0.986 6）；调整系数R2Adj=0.969 4，说明该模型拟合程度较高；失拟项不显著（p=0.360 4＞0.050 0），表明该模型可适用于对椪柑白兰地原料酒发酵工艺条件优化的分析预测。一次项A，B，C 和二次项A，B，C 影响均达到极显著水平（p＜0.01），说明考查的3 个因素对椪柑白兰地原料酒的酒精度影响较大。交互项AB，BC 对响应值影响显著（p＜0.05），而AC 项影响不显著（p＞0.05）。从F 值大小可知，3 个因素对椪柑白兰地原料酒酒精度的影响程度依次为初始糖度＞酵母添加量＞发酵温度。

2.2.3 各因素交互作用分析

各因素交互作用的响应面图见图6。

图6 各因素交互作用的响应面图

由图6 可知，随着各因素水平的升高，酒精度呈先上升后下降的整体趋势。曲面坡度越陡，说明其对响应值的影响越大，故各因素对酒精度的影响由大到小依次是A＞B＞C。同时，等高线的形状能反映出各因素交互作用所产生的影响程度，等高线越接近椭圆形，说明交互作用越显著[17]。据图6 分析可得，AB，BC 线较密集且呈椭圆状，表明初始糖度和酵母添加量、发酵温度和酵母添加量交互作用较强，影响显著（p＜0.05）；AC 线接近圆形，表明初始糖度和发酵温度交互项影响不显著。响应面分析与方差分析结果相一致。

2.2.4 验证试验

通过Design Expert 分析优化，以酒精度为评价指标，椪柑白兰地原料酒发酵工艺优化条件为酵母添加量0.22%，初始糖度23.55%，发酵温度24.93 ℃，此条件下的酒精度为13.072 9%Vol。结合单因素试验和实际可操作性，调整工艺参数为酵母添加量0.22%，初始糖度24%，发酵温度25 ℃，发酵时间7 d，发酵液pH 值4.1，验证试验取3 次重复试验的平均值，酒精度为13.05%Vol，且接近模型理论预测值，表明该理论模型与试验实际结果的吻合度较高，采用响应面法优化后的椪柑白兰地原料酒发酵工艺条件具有较高参考价值。

3 结论

以椪柑果汁为原料，在开展椪柑白兰地原料酒发酵的单因素试验基础上，通过Box-behnken 试验设计对发酵工艺条件进行优化，试验结果表明酵母用量、初始糖度、发酵温度等3 个因素对椪柑白兰地原料酒的发酵效果影响较大，影响大小依次为初始糖度＞酵母添加量＞发酵温度，确定椪柑白兰地原料酒发酵工艺优化条件为酵母添加量0.22%，初始糖度24%，发酵温度25 ℃，发酵时间7 d，发酵液pH 值4.1。在此优化条件下，得到椪柑白兰地原料酒的酒精度为13.05%Vol。综上，响应面法用于椪柑白兰地原料酒发酵工艺条件优化为可行方法。