藜麦多酚超声微波协同提取工艺优化及其抗氧化活性研究

王露晨，郭星辰，2，马金谱，2，张玉璇，2，张竞文， 高丹丹，2

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730124；2.西北民族大学生物医学研究中心，甘肃兰州 730030）

藜麦（Chenopodium quinoa Willd）源于5 000 年前安第斯地区土著居民，以营养全面、比例均衡而有别于其他传统谷物[1]，因含有较丰富的阿魏酸、辛酸、没食子酸、山奈酚、异鼠李素和芦丁等[2]生物活性组分被正式推荐为最适宜人类的完美“全营养食品”，因此被联合国粮农组织确认为唯一一种满足人体基本营养需求的单体植物[3]。研究发现，藜麦具有均衡补充营养、增强机体功能、调节免疫和内分泌、提高机体应激能力、降低糖尿病风险、修复受损的组织和细胞等保健功能[4]，对人类的代谢、心血管疾病[5]和胃肠道健康有积极影响[6]，适于婴幼儿、孕产妇、老年人等特殊体质人群食用[7]。

植物多酚属于植物次级代谢产物，广泛存在于植物的根、茎、皮、叶及果实内，是一种含有多个酚羟基的天然化合物。近年来，膳食植物性多酚化合物因其具有抗氧化、抑菌消炎、抗病毒、维持肠道健康等多种功效和生物活性[8-10]，在生化、制药、食品及精细化工等领域具有广阔前景而备受人们关注[11-14]。研究表明，藜麦中多酚含量较为丰富，藜麦叶片提取的酚类物质，具有较强的抗氧化活性[15]，其中单体酚能够抑制癌细胞的增殖[16-17]。

目前，藜麦多酚的提取工艺多以传统的乙醇法、双水相法等为主，研究选取乙醇作为多酚物质的提取剂，采用超声-微波辅助提取法提取藜麦多酚，在单因素试验基础上，结合响应面分析结果，优化超声微波协同提取法提取藜麦多酚的最优工艺参数，并以清除DPPH 自由基、OH 自由基、O2-自由基的能力作为抗氧化活性能力的评价指标对藜麦多酚抗氧化能力进行分析，以期为开发及综合利用藜麦功能性产品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验原材料与试剂

藜麦，青海新绿康食品公司提供；没食子酸标准品（分析纯），美国Sigma 公司提供、DPPH 溶液、福林酚（分析纯），上海中泰化学试剂有限公司提供；抗坏血酸、氯仿、正丁醇、无水乙醚，均为国产分析纯试剂。

1.1.2 仪器与设备

微型植物试样粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司产品；TGL-16M 型高速台式冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器开发有限公司产品；723P 型分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；N-1001 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂产品；A-1000S 型抽滤机，上海爱朗仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 藜麦多酚提取工艺流程

藜麦→粉碎过筛（80 目筛）→脱脂（3 倍量石油醚）→振荡混匀（2 h）→抽滤干燥→配制1 g/mL 多酚提取液→超声-微波辅助提取→离心（转速500 r/min，时间15 min）→取上清液→冷冻干燥→藜麦多酚样品→福林酚法测定多酚含量。

1.2.2 单因素试验设计

精确称取2.0 g 藜麦，以藜麦多酚含量为指标，固定超声功率为120 W，微波功率为60 Hz，考查不同提取温度（40，50，60，70，80 ℃）、提取时间（20，30，40，50，60 min）和乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%，80%）对藜麦多酚提取率的影响。

1.2.3 Box-behnken 响应面试验设计

为考查乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和提取温度（C）这3 个因素对藜麦多酚提取率的影响，试验以多酚提取率（Y）作为响应值，运用Design Expert V8.0.8.1 软件中的Box-behnken 设计原理，对响应面试验进行设计。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

1.2.4 藜麦多酚抗氧化活性测定

（1）DPPH 自由基清除能力。参考李东辉等人[17]的方法，分别吸取用无水乙醇配置成的不同质量浓度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL）的总藜麦多酚溶液2 mL，加入DPPH 溶液2 mL 等体积混合，避光反应30 min，以无水乙醇作为参比溶液，于波长517 nm 处测定其吸光度Ax；取2 mL 的不同质量浓度样品溶液与去离子水等体积混合液，吸光度记为A2；2 mL DPPH 溶液与去离子水等体积混合液的吸光度A1，每个质量浓度的样品做3 个平行，取平均值计算提取液对DPPH 自由基的清除率，以相同质量浓度的抗坏血酸（维C）作为阳性对照，平行测定3 次，详见公式（1）。

式中：A1——样品的吸光度；

A2——对照组的吸光度；

Ax——空白组的吸光度。

（2）OH 自由基清除能力测定。参考向卓亚等人[18]的方法并作一定改进，分别吸取用无水乙醇配置的不同质量浓度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL）的总藜麦多酚溶液，依次加入浓度为9 mmol/L 的水杨酸溶液2 mL，8 mmol/L 硫酸亚铁溶液2 mL，再加入9 mmol/L 过氧化氢溶液2 mL，同时于37 ℃水浴中加热30 min，于波长510 nm 处测其吸光度为Ai；用等体积等离子水替换H2O2溶液，重复操作同时测定其吸光度为A0；用等体积的蒸馏水替换上述方法中的藜麦多酚溶液，测定其吸光值为Aj，取平均值计算OH 自由基的清除率，以相同质量浓度的抗坏血酸（维C）为阳性对照，平行测定3 次，详见公式（2）。

式中：Ao——空白组的吸光度；

Ai——样品的吸光度；

Aj——空白组的吸光度。

（3）O2-自由基清除能力。参考关海宁等人[19]的方法并作改进，将不同质量浓度（0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL）的样品溶液取1 mL，加入pH 值为8.2 的Tris-HCl 缓冲溶液（0.05 mol/L）3 mL，混合后25 ℃水浴20 min，加入3 mmol/L 的邻苯三酚溶液0.4 mL，均匀混合，于25 ℃水浴中加热5 min，加入浓度为10 mol/L 的HCl 溶液0.1 mL 后，于波长320 nm 处测得其吸光度为As；同时用去离子水代替邻苯三酚，测定其吸光度为A0；用去离子水代替样液，测其吸光度为Ac，每个质量浓度的样品做3 个平行，取平均值计算提取液对O2-自由基的清除率，以抗坏血酸（维C）为阳性对照，平行测定3 次，详见公式（3）。

式中：Ac——空白组的吸光度；

As——样品的吸光度；

A0——空白组的吸光度。

1.2.5 数据分析

试验所得的数据均重复3 次，结果取其平均值，使用Origin 8.6 软件作图，利用Design Expert V8.0.6软件对响应面试验进行分析，利用SPSS 26.0 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 藜麦多酚提取的单因素试验结果分析

2.1.1 不同乙醇体积分数对藜麦多酚提取率的影响

乙醇体积分数对藜麦多酚提取率的影响见图1。

图1 乙醇体积分数对藜麦多酚提取率的影响

由图1 可知，藜麦多酚提取率在乙醇体积分数大于60%时呈现下降趋势，可能与多酚的亲水性与疏水性有关：当乙醇水混合液与多酚的极性越接近，多酚复合物提取率也随之越大，反之结构极性差异越悬殊，则越不利于多酚复合物的浸出，故选取乙醇体积分数60%为响应面分析的中心点。游新勇等人[20]在响应面法优化藜麦种子中多酚提取工艺的提取试验中，得出在相同的乙醇体积分数下，多酚提取率也达到了最大值。

2.1.2 不同提取时间对藜麦多酚提取率的影响

提取时间对藜麦多酚提取率的影响见图2。

图2 提取时间对藜麦多酚提取率的影响

由图2 可知，随着提取时间的继续延长，藜麦多酚的提取率呈先升后降的趋势。原因可能是随着提取时间的延长，乙醇和多酚复合物的接触时间增加，有利于多酚复合物的释放，但时间超过一定界限，多酚复合物的不稳定性，加之在提取过程中氧气的混入，导致多酚氧化分解，使多酚的提取率下降。因此，选取40 min 为最佳的提取时间。陆敏佳等人[21]在藜麦叶片多酚最佳提取工艺及其抗氧化性研究中得出同样的结论。

2.1.3 不同提取温度对藜麦多酚提取率的影响

不同提取温度对藜麦多酚提取率的影响见图3。

图3 不同提取温度对藜麦多酚提取率的影响

由图3 可知，随着提取温度的升高藜麦多酚提取率先升高而后降低，可能是由于提取温度过低时提取程度不够，致使藜麦多酚提取率不高；提取温度过高时，藜麦多酚复合物易分解，致使藜麦多酚的提取率降低。侯敏娜等人[22]在响应面法优化红薯叶多酚超声辅助提取工艺的试验中，在60 ℃的提取温度下，多酚提取率也达到最大值，故选取60 ℃作为藜麦多酚提取温度的零水平对应值进行响应面分析。

2.2 响应面结果分析

2.2.1 回归方程的建立及方差分析

分析藜麦多酚提取工艺的响应面分析试验并依据Box-behnken 中心法设计了17 组试验，合计5 组中心点重复试验。

响应面试验设计及多酚提取率见表2。

表2 响应面试验设计及多酚提取率

利用Design Expert 6.0 软件对表2 中的试验数据进行多元回归拟合并得到回归方程：

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

以藜麦多酚提取率为响应值，乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和提取温度（C）3 个因素为自变量的回归方程模型进行了生物统计学分析和显著性检验。响应面模型在数学统计学上呈极显著（p＜0.000 1），表明试验方法是可靠的，说明响应面确立的试验模型具有较大的数学统计学意义，该方程对模拟真实的三因素三水平的分析可行。

变量中的一次项A，B，以及二次项A2，B2和C2均对藜麦多酚提取率影响极显著，交互项中的AC，BC 对响应值影响显著，表明在藜麦多酚提取的过程中，乙醇体积分数和提取时间对藜麦多酚的提取率有显著影响，乙醇体积分数和提取温度、提取时间和提取温度的交互作用也会对藜麦多酚的提取率造成显著影响，试验中的3 个因素当中，对藜麦多酚提取率的影响顺序为B＞A＞C。失拟项p 值为0.147 3，显著小于0.01，说明试验设计和软件分析的模型拟合度较好，响应面模型选择科学合理，残差的形成可能与试验过程不可避免的随机误差有关。R2Adj为0.988 1，R2为0.994 8，反映了试验值与响应面的预测值具有较高的吻合度。C.V.值为0.79%，说明该响应面模型能够科学真实地再现试验结果，进一步证明了试验操作的合理性。

2.2.2 响应面与等高线分析

通过响应面二次多项模型方程的建立，得出响应面的曲面图。

各因素交互作用对藜麦多酚提取率影响的响应面图及等高线图见图4。

图4 各因素交互作用对藜麦多酚提取率影响的响应面图及等高线图

等高线的偏离程度及响应曲面的曲面坡度可直观地反映不同因素间的交互作用[23-25]，乙醇体积分数与提取温度的交互作用对总藜麦多酚提取率的影响程度最大，提取时间和提取温度的影响次之，乙醇体积分数与提取时间对藜麦多酚提取率的影响最小，不同因素的交互作用对藜麦多酚提取率影响的显著性为AC＞BC＞AB，与表3 中的方差分析结果一致。由图4 中的响应面图和等高线图可得，试验中选取的3 个因素对响应值的影响较为一致，随着各因素的增大，藜麦多酚的提取率也相应增大，并在到达最大值后呈下降趋势。等高线图中的椭圆程度和疏密程度有着与响应面图相同，并与响应面模型生物统计学分析一致，图4 中的等高线呈椭圆形，说明了乙醇体积分数和时间之间，乙醇体积分数和温度之间及时间和温度的交互作用显著。

2.2.3 藜麦多酚最优提取条件的确定及验证

提取藜麦多酚的最佳工艺可经响应面软件优化得到，提取时间为40 min，乙醇体积分数为50%，提取温度为50 ℃，该条件下得到的藜麦多酚提取率为0.923%。为了验证响应面法的可行性，用最佳工艺条件进行藜麦多酚提取的验证性试验，通过3 组平行试验得到藜麦多酚提取率为0.919%，0.922%，0.925%，平均提取率为0.922%，误差小于±1%，且得到的藜麦多酚具有较强的抗氧化能力，可见该模型能较好地预测实际藜麦多酚提取率。

2.3 藜麦多酚抗氧化活性分析

2.3.1 藜麦多酚对DPPH 自由基清除能力测定

藜麦多酚和维C 对DPPH 自由基的清除率见图5。

图5 藜麦多酚和维C 对DPPH 自由基的清除率

由图5 可知，在一定试验质量浓度区间内，随着质量浓度的不断提高，藜麦多酚清除能力逐渐增大。DPPH 自由基清除达到半抑制率（IC50）的藜麦多酚质量浓度为0.076 mg/mL，维C 为0.070 mg/mL，说明藜麦多酚具有一定清除DPPH 自由基的能力。

2.3.2 藜麦多酚对·OH 清除能力测定

藜麦多酚和维C 对·OH 的清除率见图6。

图6 藜麦多酚和维C 对·OH 的清除率

由图6 可知，在所选试验质量浓度区间内，藜麦多酚清除能力随着质量浓度的提高逐渐增大，但维C 的清除率始终大于藜麦多酚。对·OH 清除达到半抑制率（IC50）的藜麦多酚质量浓度为0.024 mg/mL，维C 为0.064 mg/mL，说明藜麦多酚具有一定清除羟自由基的能力。

2.3.3 藜麦多酚对O2-·清除能力测定

藜麦多酚和维C 对O2-·的清除率见图7。

图7 藜麦多酚和维C 对O2-·的清除率

由图7 可知，在所选试验质量浓度区间内，藜麦多酚清除能力随着多酚质量浓度的提高逐渐增大，当浓度大于0.3 mg/mL 时，O2-·清除率上升较为缓慢，之后随着质量浓度提高，清除率最终几乎不变。对O2-·清除达到半抑制率（IC50）的藜麦多酚质量浓度为0.021 mg/mL，抗坏血酸（维C）为0.091 mg/mL，尽管藜麦多酚对所测的O2-·的清除率不及参照物抗坏血酸（维C），但藜麦多酚仍具有相当的清除O2-·的能力。

3 结论

用超声-辅助提取法提取藜麦多酚，利用单因素试验结合响应面软件分析优化藜麦多酚超声-辅助提取工艺，结果表明藜麦多酚的最优提取工艺为超声功率120 W，微波功率60 Hz，乙醇体积分数50%，提取时间40 min，提取温度50 ℃，该工艺条件下藜麦多酚提取率为0.923%，各因素对样液中多酚含量的影响顺序为时间（B）＞乙醇体积分数（A）＞提取温度（C）。在藜麦多酚提取的过程中，提取时间和乙醇体积分数对提取率有显著的影响（p＜0.01），乙醇体积分数和提取温度、提取时间和提取温度的交互作用也会对多酚提取率造成显著影响（p＜0.05）。同时，体外抗氧化试验表明藜麦多酚对所测的3 种自由基的清除率不及参照物抗坏血酸（维C），但是仍能体现其具有一定的抗氧化能力，为今后藜麦中功能成分的提取和综合开发应用提供理论技术依据。