间作黄芪对当归根际土壤微生物的影响

李媛媛，谢丰璞，王楠，高静，黄文静，李铂，孙晓春，宋忠兴，唐志书，王二欢，马存德

（1.陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心 / 秦药特色资源研究与开发国家重点实验室（培育），陕西 咸阳 712083；2.陕西中医药大学 药学院 陕西省中医药管理局“秦药”研发重点实验室，陕西 西安 712046；3.陕西步长制药有限公司，陕西 咸阳 712000）

微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统稳定性和可持续性至关重要［1］。根际土壤微生物多样性对种植模式非常敏感［2］，持续单作会使有益菌丰度降低并增加致病菌数量，造成土壤微生态环境失衡，进而影响植物的生长发育［3］。合理间作能够优化土壤微生物的群落结构，使有益微生物优势度及丰富度上升，提高其代谢活性和功能多样性［1］，并使植物生存空间互补扩大，促进资源的高效利用［4］。间作体系利用地上植物多样性与地下微生物多样性的紧密联系来改善土壤环境［5］，是现存耕作措施的完善策略［6］。

伞形科植物当归［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］的干燥根，是我国常用的大宗药材之一。传统单一的种植方式会造成当归连作障碍，严重影响当归产业的可持续性发展［7］。已有研究发现当归间作其他作物可以有效促进当归生长，提高其品质，并能适当减少当归麻口病的发病率，对连作障碍也有一定的缓解作用［8］。豆科因其特有的根瘤固氮能力而被广泛运用于生态农业系统［8］。间作豆科植物可有效改善土壤条件、提高土壤养分及维持土壤稳定性。药材黄芪为豆科植物膜荚黄芪［Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge.］或蒙古黄芪［Astragalus membranaceus（Fisch.） Bge. var.mongholicus（Bge.） Hsiao］的干燥根，是中成药制药过程中用量巨大的原料药［9］。前人研究发现黄芪茬口适宜当归熟地育苗［10］，且在此茬口下的当归产量和品质皆佳［11］。此外，豆科茬口有利于增加当归根际土壤细菌群落总数，提高细菌群落多样性，对当归根际土壤具有较好的调节作用［12］。本研究结合前人结论，探讨了当归单作及其与黄芪间作后土壤微生物的响应方式，以期为改良当归生长的土壤环境，提高其产量和品质提供新思路。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验在甘肃省陇南市宕昌县当地市场选取长势良好、外状健康的当归和膜荚黄芪苗株，田间试验于宕昌县阿坞乡麻界村步长药业药源生产基地（116°30'53.38＂E，39°48'35.35＂N）进行当归单作和当归-黄芪间作种植。该基地属于温带大陆性气候，土壤为黑垆土，前茬作物为马铃薯，土壤肥力均匀，每个小区面积4 m × 6 m，每个小区按照每亩20 kg的尿素，30 kg的磷酸二铵作为基肥在耕翻土地时一次性施入覆膜栽培，株行距20 cm × 20 cm。分别于7月和11月采集间、单作下当归根际土壤样本，取样前清除土壤表层的杂物，并清除土壤样品中枝叶、乱石等杂物，土样通过直径2 mm的筛网过滤后于4℃冰箱保存，用于土壤微生物群落结构及功能分析。

1.2 DNA提取

使用Fast DNA SPIN提取试剂盒（美国MP Biomedicals公司）提取细菌基因组DNA样本，将提取DNA的数量和质量分别用ND-1000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）和琼脂糖凝胶电泳（DDY-6C，北京六一公司）测定，并在-20℃下保存。

1.3 高通量测序

采用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对土壤细菌16S rRNA基因V3 ～ V4区进行PCR扩增。扩增体系包括5 μL Q5反应缓冲液、5 μL Q5 High-Fidelity GC buffer、0.25 μL Q5 High-Fidelity DNA聚合酶、2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL、正反向引物各1 μL、2 μL DNA模板和8.75 μL ddH2O。扩增条件：98℃，2 min；98℃，15 s；55℃，30 s；72℃，30 s；72℃延伸5 min；25次循环。PCR扩增产物采用Agencourt Ampure Beads 试剂盒（美国Beckman Coulter公司）纯化，用PicoGreen dsDNA检测试剂盒（美国Invitrogen公司）定量。采用上海派森诺生物科技股份有限公司的Illumina Miseq平台和Miseq Reagent Kit v3进行测序。高通量数据采用QIIME v1.8.0进行微生物定量分析来处理测序数据。运用PICRUSt软件预测功能基因。将QIIME获得的OTU信息与KEGG的一级和二级代谢通路的功能基因类别划分归类，获得功能基因组成。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2019软件和IBM SPSS Statistics 26统计分析软件对数据进行差异显著性分析（LSD法，P＜ 0.05），运用Graphpad Prism 8.0.1和R 4.1.3进行绘图。

2 结果与分析

2.1 微生物多样性

α多样性中的Chao1指数和ACE指数能反映土壤细菌群落丰富度，与群落多样性呈正相关。不同时间下，两种种植模式的Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数均在11月时最大（表1）。Chao1指数在11月间作下比7月间作下显著升高45.01%，7月下的间作比单作提高18.83%；ACE指数在11月间作下比7月间作下显著升高44.99%，7月下的间作比单作提高24.24%。不同种植方式下的Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数均在11月时高于7月，ACE指数在7月单作下低于其他处理。

表1 不同时间下种植方式对α多样性的影响Tab. 1 Effects of planting methods on α diversity at different times

2.2 微生物群落结构

由图1（A）可看出，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）和芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）为细菌优势门，分别为26.32% ～33.17%、12.49% ～ 19.29%、12.48% ～ 14.89、7.73% ～12.91%、7.48% ～ 10.94%。此外，结果表明，芽单胞菌门相对丰度在7月和11月间作模式下均高于单作；变形菌门的相对丰度在7月单作下较高于其他三种情况；放线菌门的相对丰度在11月间作下低于其他三种处理；绿弯菌门的相对丰度在11月单作下较为突出，这些差异应该是受到外界气候环境与种植模式的双重影响所致。

据图1（B）可知，变形菌门下的α变形菌纲（Alphaproteobacteria）、β变形菌纲（Betaproteobacteria）、γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）、δ变形菌纲（Deltaproteobacteria），放线菌门下的放线菌纲（Actinobacteria）、嗜热油菌纲（Thermoleophilia）、酸微菌纲（Acidimicrobiia），酸杆菌门下的芽球菌纲（Blastocatellia）、全噬菌纲（Holophagae），绿弯菌门下的绿弯菌纲（Chloroflexia）、热微菌纲（Thermomicrobia），芽单胞菌门下的芽单胞菌纲（Gemmatimonadetes）共12种纲占比相对较多。通过比较不同处理发现，γ变形菌纲的相对丰度在11月间作模式下最为显著，全噬菌纲的相对丰度在7月间作时显著。α变形菌纲和嗜热油菌纲的相对丰度在7月间作和11月单作下均高于7月单作和11月间作。芽单胞菌纲的相对丰度在7月和11月下有所不同，热微菌纲的相对丰度在11月单作时高于其他处理。不同种植时间与种植方式下酸微菌纲、酸杆菌纲间差异均不显著。

2.3 PICRUSt基因预测

通过与KEGG数据库比对和注释，获得了与土壤微生物生态系统功能密切相关的4类KEGG一级代谢通路功能基因，即细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和代谢及这4类功能下属的23类二级通路功能基因（表2）。其中，转录（G3）、能量代谢（M4）的相对丰度表现出在11月间作下显著于其他处理；细胞生长与死亡（C2）、脂质代谢（M7）的相对丰度在7月间、单作下显著高于11月间、单作；细胞运动（C3）、运输和分解代谢（C4）、碳水化合物代谢（E3）的相对丰度在7月间、单作下较高于11月间、单作；翻译（G4）、核苷酸代谢（M11）及折叠、分类和降解（G1）3类功能基因的相对丰度在11月间、单作下明显高于7月间、单作；此外，细胞通讯（C1）、复制和修复（G2）、聚糖代谢与生物合成（M6）的相对丰度在7月单作下高于7月间作及11月间、单作；膜运输（E1）、氨基酸代谢（M1）、碳水化合物代谢（M3）3类功能基因的相对丰度在11月单作下较高；代谢功能下属的其他次级代谢产物的生物合成（M2）、酶家族（M5）、辅助因子和维生素的代谢（M8）、其他氨基酸的代谢（M9）、外源生物降解与代谢（M12）5种功能基因的相对丰度均无显著差异。

表2 KEGG二级代谢通路基因相对丰度随时间与种植方式的变化特征Tab. 2 Changes in relative abundance of KEGG secondary metabolic pathway genes with time and planting patterns

2.4 KEGG代谢通路

在探究了土壤微生物群落结构与功能之后，将土壤微生物参与KEGG代谢通路归纳为反硝化作用、固氮作用、硝化作用三种，可以看出不同种植时间及种植方式之间差异显著。在反硝化反应中，7月间作的土壤微生物参与到K00371（narH/narY/nxrB）、K00374（narI/narV）代谢通路的OTU数显著高于7月单作，在K02567（napA）、K00362（nirB）、K00363（nirD）、K00368（nirK）、K00370（narG/narZ/nxrA）代谢通路中差异较为明显，而在K02305（norC）、K03385（nrfA）代谢通路中差异不明显；11月间作土壤微生物参与到K02305（norC）代谢通路的OTU数明显多于11月单作。在固氮作用中，7月间作土壤微生物参与到K00531（anfG）代谢通路的OTU数明显高于7月单作，但在11月间、单作下差异不显著。在硝化反应中，不同时间的间作下土壤微生物参与到K10535（hao）代谢通路的OTU数差异均较为明显（图2）。

图2 不同时间及种植方式下土壤KEGG二级代谢通路基因相对丰度热图Fig.2 Heatmap of the relative abundance of genes in soil KEGG secondary metabolic pathway under different time and planting methods

2.5 种植模式对土壤微生物网络共生的影响

根据不同种植方式下土壤微生物测序的结果，构建微生物群落分子生态网络，识别群落中的微生物相互作用。网络特征参数的分析表明（表3），门、纲水平下的间作网络中节点数、连接数、平均度和模块化、平均群聚系数和路径长度均高于单作网络，而门水平下的单作网络中网络密度略高。网络节点间的作用有正、负相关性之分，间作门和纲的网络中均为正相关大于负相关（图3）。较高的正相关性代表更好的相互作用，也更有利于微生物功能的发挥。

图3 土壤微生物互相作用网络图Fig.3 Interaction network diagram of soil microbes

表3 土壤微生物分子生态网络特征参数Tab. 3 Characteristic parameters of the molecular ecological network of soil microbe

3 讨论与结论

3.1 间作黄芪对当归土壤α多样性的影响

微生物是土壤有机质的分解者，也是调控土壤养分的关键因素之一，其α多样性等群落特征受植物种植模式、土壤环境等影响［13-14］。间作下植物根系相互作用产生的代谢物会引起土壤微生物整体代谢活性发生变化，导致土壤微生物群落结构具有多样性，从而调节土壤微生态环境［15-16］。合理的间作会促使根系相互作用释放出更丰富的根系分泌物，为土壤微生物的繁殖提供良好的土壤理化条件［17］。常换换等［18］发现玉米间作大豆模式下，受种间互作影响，玉米和大豆根际吸取更多的养分，促进根际微生物增殖，且提高根际微生物多样性。本研究符合前人总结趋势，与单作相比，间作黄芪提高了当归根际土壤微生物的Chao1指数和ACE指数，推测是其与黄芪间作对细菌群落有良好的调节作用，能够促进有益菌的生长与繁殖，有利于保证当归的优质与产量。

3.2 间作黄芪对当归土壤细菌群落结构的影响

土壤微生物易受温度和降水量等环境因素的影响，细菌在土壤环境中的移动及获取营养物质的过程均需依赖于土壤中水膜的流动［19］，不同季节的土壤温度不同，导致土壤水分状态有所差异。本试验发现7月时变形菌门的相对丰度较高于11月，而11月时绿弯菌门的相对丰度较为突出，放线菌门的相对丰度低于7月。前人研究发现放线菌数量在春夏时高，秋冬时低［20］，变形菌门和酸杆菌门的相对丰度则随温度呈现相反趋势［21］，芽单胞菌门具有适应干旱的能力［22］。季节对变形菌门、放线菌门、酸杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度影响规律有所不同，但一般而言，夏季雨热同期，有利于细菌生存［20，23-24］。变形杆菌、酸杆菌和放线菌能够降解土壤有机质中的多糖［25］，促进养分循环。其中放线菌门能降解纤维素和几丁质，是土壤养分供给的主要来源［26］。施用有机肥为变形杆菌和放线菌繁殖提供适当的土壤环境和养分［27］。间作豆科植物提高了土壤有机质和碱解氮含量，从而创造适宜变形菌门等繁衍的高肥力土壤环境［28］。且推断芽单胞菌门与速效氮、磷表现为显著正相关，绿弯菌门与有机质存在负相关关系［29］。研究发现，燕麦与豆科间作可改善土壤固氮作用并增加作物对氮和磷等养分的吸收，从而引起依赖这些营养元素的α、β、γ变形菌纲富集［30-31］；茶树与桂树或含笑树间作时地下部分的相互作用使根际分泌物增加进而影响细菌群落结构，导致放线菌纲和拟杆菌纲等相对丰度增加［32］。本试验与前人研究结果相似，推断γ变形菌纲等显性细菌群会受间作所产生的根际分泌物影响而大量累积，并在支持分解和养分循环等关键生态系统过程中发挥重要作用［33］。

3.3 间作黄芪对当归土壤细菌功能的影响

本研究发现能量代谢和转录功能在单、间作方式之间存在差异，脂质代谢和碳水化合物代谢等在不同采样时间有所不同，其原因可能是受化能异养菌、光能营养菌和化能自养菌的相对丰度影响，土壤理化性质和环境因子通过改变细菌群落结构及次生代谢物的组成而得到改善［34］。研究表明，参与新陈代谢的细菌类群多与氨基酸、碳水化合物和能量代谢功能有关；参与膜运输的菌群主要负责复制和修复及环境信息处理，其在遗传信息处理上有明显优势［34］。另外，碳水化合物代谢可促进氮、磷循环，间接说明土壤细菌丰富度高有利于氮、磷的转化和迁移［35］。当归与黄芪间作可以导致类似增加植物群落多样性的现象，不但提高了土壤细菌功能，而且增加了功能上的丰富性。

3.4 间作黄芪对当归土壤氮循环的影响

土壤氮素循环主要由微生物推动进行［36］，功能基因标记通常用于描述负责特定氮转化过程的微生物群落的丰度和多样性［37］。变形菌门通过改善土壤水分和养分含量而富集，是促进反硝化的重要类群［38］，酸杆菌也具有反硝化活性，能以亚硝酸盐作为氮源［39］。反硝化是将硝酸盐或其他含氮小分子转化为氮气的生物过程。反硝化作用的功能基因丰度增加，表明间作加强了土壤的反硝化过程。生物固氮是新氮的主要自然来源，分子态氮在生物体内还原为氨的过程中大多数固氮微生物属于变形杆菌，是需氧微生物［40-41］。硝化作用是氨在氧条件下生成亚硝酸盐的过程［42］。相关研究发现土壤中隶属于β-变形菌纲的氨氧化细菌，可通过调整种群结构适应土壤环境因子的改变，进而推动土壤的硝化过程［43］。细菌在土壤氮循环中起着重要作用，酸杆菌门、放线菌门等种群的相对丰度与大多数KEGG代谢通路关系密切，说明这些细菌种群对群落功能的发挥可能起着主导作用［44］。土壤微生物通过影响通路功能基因作用于氮循环，推断是间作及季节所产生的积极影响。

3.5 间作黄芪对当归土壤网络共生的影响

土壤微生物彼此之间存在复杂的关联网络［45］，网络的拓扑属性可以反映群落的稳定性或功能的多样性［46］。节点与连接数越多，表现为网络连接更为紧密、复杂。一般认为较高的模块化是提高网络稳定性及促进微生物组成稳定性的关键［47］，平均群聚系数和平均路径长度表示网络连接的密度［48］。网络平均路径距离能表明土壤微生物间响应速度，较短时易受外界环境的干扰，群落结构稳定性差；较长时土壤微生物间的响应速度较慢，当外界环境发生变化时群落结构就可以保持相对稳定［49］。本试验发现在门、纲水平上间作土壤微生物网络中的节点数、平均度、连接数、模块化、平均群聚系数和正相关均高于单作网络，表明间作模式下网络结构更为复杂且连接紧密，微生物结构更稳定，不易受干扰且能更好的发挥作用，推测是当归间作黄芪时根际土壤微生物相互作用，形成更具互动性的细菌群落，提高抵抗外界干扰的能力。

综上，当归间作黄芪改变土壤微生物群落结构和丰富度，在不同季节下能促进有益菌繁殖并提高其功能，同时能通过影响通路功能基因而促进氮循环。间作共生网络更加复杂、联系紧密且不易受外界干扰。研究结果为当归间作黄芪根际土壤微生物的多样性及当归生态种植提供理论依据。