西藏杓兰菌根真菌多样性水平及共生关系研究

安曼云

（云南经济管理学院，云南 昆明 650000）

西藏杓兰（Cypripedium tibeticumKing ex Rolfe）属兰科（Orchidacaea）植物，分布于中国西藏、云南、四川、甘肃、陕西等地。西藏杓兰具有较高的观赏及药用价值，其原生种群数量逐年减少，已成为野生濒危植物［1-3］。由于杓兰属植物种子自然萌发率和幼苗成活率极低，限制了其人工栽培和繁育工作，杓兰保育研究已迫在眉睫［4］。

研究表明，菌根是自然界中普遍存在的一种共生现象，兰科植物与土壤中的菌根真菌共生，可形成兰科菌根［5-6］。杓兰属植物是典型的兰科菌根真菌共生植物，其种子萌发、生长发育等各阶段都需要与菌根真菌建立共生关系［7］。目前，对于杓兰属植物菌根的研究主要集中在解剖结构特征、真菌多样性、共生关系等方面。权娇娇等［8］研究发现黄花杓兰（Cypripedium flavumP. F. Hunt et Summerh）菌根真菌类型丰富多样，涉及6个菌属的真菌，胶膜菌属为优势菌群。高倩等［9］研究发现4种杓兰的生长周期中，其菌根真菌的入侵-消解呈现出周期规律，杓兰利用真菌菌丝消解后的营养物质进行混合营养。徐玲玲等［10］研究了环境变化对杓兰属植物菌根真菌区系组成的影响，表明在同一栖息地，杓兰对菌根真菌的偏好性显著影响其菌根真菌群落结构；此外，随着海拔的升高，西藏杓兰菌根真菌多样性减少。杨前宇等［11］研究表明菌根真菌可以促进兰科植物幼苗的生长。

已有的研究表明菌根真菌与杓兰属植物之间具有较强的互作规律，在不同生长时期和不同生境条件下真菌种类和多样性存在差异。然而，西藏杓兰菌根真菌多样性水平及其促生作用的研究未见报道。故本研究采用微生物纯培养方法检测了滇西北4个不同居群的西藏杓兰菌根真菌组成及多样性水平，掌握不同真菌类型对种子和幼苗的共生促生作用，为西藏杓兰的繁育及保护提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采集地点位于滇西北香格里拉县天生桥区域，海拔3 370 m。西藏杓兰（C. tibeticum）生于林缘，为腐殖质土壤生境。4个居群样地分布数量为20 ～ 50 株/100 m2。西藏杓兰根部样品采集：2020年6月份，每个居群随机选取20株，每株不同分布方向选取10个毛根段；种子采集：2020年10月份进行蒴果采集，置于4℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 菌根真菌分离

采用组织块分离方法进行菌根真菌的分离与纯化，培养基分别采用马丁-孟加拉红培养基和马铃薯葡萄糖培养基。根据形态特征和ITS扩增测序进行菌根真菌的种属确定。按以下公式统计分离率、分离频率和相似性指数。

式中：a为分离到的某一指定类型真菌的菌株数量；b为分离样品组织块总数。

式中：a为分离到的某一指定类型真菌的菌株数量；b为分离的真菌菌株数量。

式中：j为两个样地共有种数；a是一个样区的植物样本中真菌种数；b是另一个样区的植物样本中真菌种数。

1.2.2 西藏杓兰种子共生萌发试验

1.2.2.1 种子活力检测

采用TTC染色法（Triphenyl tetrazolium chloride）对西藏杓兰种子进行活性检测，按以下公式统计种子胚活力。

1.2.2.2 种子萌发试验

采用无菌水制备西藏杓兰种子悬浮液，取等量悬浮液种子于Harvais培养基上。将7株（从7个菌属中分别选取一株）供试菌块（0.5 cm × 0.5 cm）分别接种于培养瓶中，以不接菌的6瓶为对照组，每种菌3个重复。每7 d进行生长情况观察，20周后进行种子萌发过程检测。

1.2.3 西藏杓兰幼苗共生生长试验

通过改良的培养基进行西藏杓兰无菌幼苗的培养，选取大小一致的无菌幼苗并准确称量后移入到培养瓶中（采用Harvais培养基），每瓶6株。分别接入7株供试菌株的菌块（1 cm × 1 cm）。以不接菌的6瓶做对照组，每种菌做3个重复。每10 d进行生长情况观察，60 d后进行相关数据测定。全氮含量采用H2SO4-H2O2-蒸馏法测定；全磷含量采用H2SO4-H2O2-消煮-钼锑抗比色法测定；全钾含量采用H2SO4-H2O2-消煮-火焰光度计法测定。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 19.0、EXCEL 2010和GraphPad Prism 8.0软件进行试验数据分析。试验数据以平均值 ± 标准差表示，Duncan氏法进行多重比较检验，不同小写字母表示差异显著（P＜ 0.05）。

2 结果与分析

2.1 西藏杓兰菌根真菌菌群的组成

从西藏杓兰4个居群的800块毛根中共分离获得366株菌根真菌，涉及7个菌属（表1）：胶膜菌属（Tulasnella）、丝核菌属（Rhizoctoia）、层孔菌属（Fomes）、毛壳菌属（Chaetomium）、角担菌属（Ceratobasidium）、伏革菌属（Corticium）和瘤菌根菌属（Epulorhiza）。在属分类水平上，优势菌群为胶膜菌属，分离率（15.88%）和分离频率（34.70%）最高，其次是丝核菌属，最少的为瘤菌根菌属（分离率1.38%）。说明西藏杓兰菌根系统中存在丰富多样的菌根真菌种群。

表1 西藏杓兰菌根真菌菌群组成Tab. 1 Composition of mycorrhizal fungi from C. tibeticum

2.2 不同居群西藏杓兰菌根真菌的组成及分离频率

西藏杓兰不同居群的菌根真菌组成、优势菌群和分离频率存在差异（表2）。其中，居群1的菌群组成涉及5个属，优势菌群为胶膜菌属（14.75%）；居群2的菌群组成涉及4个属，优势菌群为胶膜菌属（8.74%）；居群3的菌群组成涉及4个属，优势菌群为层孔菌属（7.38%）；居群4的菌群组成涉及5个属，优势菌群为丝核菌属（8.74%）。说明不同的生境特性对西藏杓兰菌根真菌菌群的组成影响极大。

表2 西藏杓兰不同居群菌根真菌的组成及分离频率Tab. 2 Composition and isolation frequency of mycorrhizal fungi from different C. tibeticum populations

2.3 西藏杓兰菌根真菌的菌群相似性系数

从表3可知，在4个居群中，居群1和居群2的菌群相似性系数最高（0.70），居群3和居群4的菌群相似性系数最低（0.44）。说明西藏杓兰在不同分布地点的菌根真菌菌群表现出一定的相似性，其中胶膜菌属、丝核菌属和层孔菌属为西藏杓兰菌根真菌的共有真菌。

表3 西藏杓兰菌根真菌菌群相似性系数Tab.3 Similarity coefficients of mycorrhizal fungi from C.tibeticum population

2.4 菌根真菌对西藏杓兰种子萌发的影响

首先，对西藏杓兰种子有胚率和活力进行了测定，西藏杓兰种子有胚率为83.85%。经过TTC染色法（Triphenyl tetrazolium chloride）检测，西藏杓兰种子胚活力为61.37%。进一步研究了菌根真菌对西藏杓兰种子萌发的影响，结果图1所示。7株供试菌株中，5株菌能促进西藏杓兰种子萌发，表现出不同的促进萌发效果。其中，CT-1-64在10周时，可促使种子叶原基出现，在15周时促使第一片叶子出现，表现出较强的共生萌发效果。

图1 菌根真菌对西藏杓兰种子萌发的影响Fig. 1 Effect of mycorrhizal fungi on seed germination of C.tibeticum

2.5 菌根真菌对西藏幼苗的促生效果分析

经过回接培养后，7株供试菌株均能与幼苗形成共生体系，且在西藏杓兰根内检测到相应的菌株。从图2可知，菌根真菌均不同程度的促进了幼苗的生长。其中，5株菌（CT-1-64、CT-1-28、CT-3-13、CT-4-87和CT-2-06）能显著促进幼苗的鲜重率（P＜ 0.05），而且都能显著促进幼苗对N、P、K元素的吸收（P＜ 0.05）。从7株供试菌株中筛选得到一株高效促生菌株CT-1-64，与其它处理组相比，均显著提高了西藏杓兰幼苗的鲜重率和营养元素含量（P＜ 0.05）。

图2 菌根真菌对西藏杓兰幼苗鲜重增长率及营养元素的影响Fig.2 Effects of mycorrhizal fungi on the growth rate of fresh weight and the content of nutrients in seedlings of C. tibeticum

3 讨论

3.1 杓兰菌根真菌多样性水平

西藏杓兰是典型的兰科菌根植物，本研究采用组织块分离法研究了西藏杓兰菌根真菌在不同居群环境中的变化，结果表明西藏杓兰存在丰富多样的菌根真菌类型，涉及7个菌属的真菌：胶膜菌属、丝核菌属、层孔菌属、毛壳菌属、角担菌属、伏革菌属和瘤菌根菌属。目前研究已知，与兰科植物共生的菌根真菌主要有担子菌门13个属（胶膜菌属、腊壳耳属、密环菌属、伏革菌属、角担菌属、层孔菌属等）、子囊菌门的3个属（毛壳菌属、青霉菌属和微囊菌属）和半知菌门14个属（瘤菌根菌属、丝核菌属、念珠菌根菌属、角菌根菌属等）［12-13］。本研究获得的7个菌属在兰科其它植物菌根中已报道，其中，胶膜菌属、丝核菌属和层孔菌属为西藏杓兰的优势菌群，且在4个不同居群中均出现，说明其对西藏杓兰具有寄主专一性。翟虹宇［14］从西藏构兰、黄花杓兰和无苞杓兰（C. bardolphianmW. W. Smith et Farrer）3种杓兰根部分离得到10个属的真菌，其中以胶膜菌属最多，占总体分离种类的33.3%。付亚娟等［15］研究发现大花杓兰（C. macranthumSw.）菌根真菌主要为胶膜菌属和丝核菌属。

3.2 杓兰菌根真菌促进种子萌发

杓兰属植物种子萌发和生长过程中，必须借助于菌根真菌为其提供营养。研究表明，在兰科种子非共生萌发时，在培养基中添加一些营养物质可促进其萌发，但萌发进程缓慢［16-17］。回接菌根真菌可通过把种子胚和基质连接起来显著缩短兰科种子的萌发过程，菌丝为胚发育提供水分、碳水化合物、养分、维生素等物质［18］。杓兰属植物的种子萌发对菌根真菌具有较强的依赖性，回接胶膜菌属菌株可显著缩短种子的萌发过程［19］。在本研究中，7株供试菌株中能促进西藏杓兰种子萌发的有5株，并对其促进萌发效果不同。其中，胶膜菌属（CT-1-64）表现出较强的共生萌发效果，能缩短种子萌发进程。

3.3 杓兰菌根真菌促进幼苗生长

兰科植物一般为肉质根，由于较少的侧根和根毛限制了其对土壤中矿质元素的吸收，而菌根真菌的菌丝可以吸收矿质元素供给宿主植物［20］。菌根真菌可以显著增加大花蕙兰（Cymbidium hybridum）、春兰［C. goeringii（Rchb. f.） Rchb. F.］等兰科植物的茎叶干重，且能促进其对N、P、K等元素的吸收，两者间建立一种互惠互利的共生关系［21-22］。本研究的7株供试菌株均能与西藏杓兰幼苗形成共生体系，不同程度的促进了幼苗的生长。其中，5株菌能显著促进幼苗的鲜重率和其对营养元素（N、P、K）的吸收。西藏杓兰种子共生萌发和幼苗生长阶段，可与多种真菌建立共生关系，表现出更强的适应性。此外，在供试的7株菌根真菌中，CT-1-64表现出了较强的共生萌发及幼苗促生效果，有希望成为杓兰属植物繁育中的高效促生菌，其促生机理有待进一步研究。