Kartogenin促进肩袖损伤修复小鼠模型腱-骨愈合的作用及机制

徐天波 刘德国 张颉鸿 郑宇翔 侯振海

肩袖损伤（rotator cuff tear，RCT）是导致肩关节疼痛、活动受限最常见的原因，严重影响患者的生活质量[1]。研究表明，RCT 的发病率可达13%～32%，与人的年龄增长密切相关[2]。尽管肩关节镜手术的发展改善了RCT 修复的临床疗效，但术后腱-骨结合部难以恢复正常的组织结构，肩袖再次撕裂的发生率仍居高不下，如何促进腱-骨界面愈合、增加其生物学强度，一直是运动医学的研究热点[3]。Kartogenin（KGN）最早在骨关节炎软骨修复研究中发现，是一种人工合成的低水溶性小分子杂环类化合物，具有诱导内源性间充质干细胞成软骨分化的特性，且无需添加外源性种子细胞和支架，在再生医学中具有广阔的应用前景[4-6]。但目前有关KGN 促进RCT 中腱-骨愈合的研究尚不多见。因此，本研究通过纤维蛋白构建KGN 释放体系，并通过小鼠RCT 修复模型探究KGN对腱-骨愈合的作用及机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 选取12 周龄雄性C57BL/6j 野生型小鼠72 只，体重25～30 g，购自广东南模生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（粤）2022-0062。本研究经本院医学伦理委员会审查通过（批准文号：DW20210325-53），所有动物实验操作均遵循3R 原则。

1.2 主要试剂及仪器 KGN 粉剂（货号：S765802）购自美国Sigma-Aldrich 公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（货号：D8371）、苏木素-伊红染液（货号：G1120）、阿尔新蓝染液（货号：G1560）、天狼星红染液（货号：G1472）均购自中国Solarbio 公司；纤维蛋白封闭剂（货号：80FZ00M3-7）购自美国OMRIX Biopharmaceuticals 公司；Trizol 裂解液（货号：15596-026）购自美国Invitrogen 公司；腱调蛋白（tenomodulin，TNMD）一抗（货号：ab203676）、血小板衍生生长因子-AA（platelet-derived growth factor-AA，PDGFAA）一抗（货号：ab203911）、Y 染色体性别决定区盒转录因子9（sexdeterming region of Y chromosome box transcription factor 9，SOX9）一抗（货号：ab185966）、SP7 转录因子（SP7 transcription factor，SP7）一抗（货号：ab22552）及兔二抗（货号：ab6702）均购自英国Abcam 公司；PCR 引物由中国上海生工合成；Evo M-MLV 反转录试剂盒Ⅱ（货号：AG11728）、Evo M-MLV 一步法qRT-PCR 试剂盒（货号：AG11732）均购自中国Accurate Biology 公司。Waters2695 液相色谱仪购自美国Waters 公司；CKX31 级双目生物显微镜购自日本OLYMPUS公司；KR4i大容量冷冻离心机购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；Leica EM UC7 冷冻超薄切片机购自德国徕卡公司；ABI 7500实时荧光定量PCR 购自美国Applied Biosystems 公司。

1.3 KGN 释放体系的构建和体外检测 参考文献[7]构建KGN 释放体系。将250 mg KGN 溶解于16.7 μL DMSO 溶液，制成KGN 原液；将纤维蛋白封闭剂置于37 ℃水浴加热10 min，使其充分融化；将上述16.7 μL KGN 原液加入233.3 μL 纤维蛋白封闭剂中，充分混匀，制成纤维蛋白-KGN 释放体系。直接将不含KGN的16.7 μL DMSO 加入233.3 μL 的纤维蛋白封闭剂中，建立纤维蛋白空载体系作为对照。为了模拟体内环境中KGN 在纤维蛋白体系中的释放情况，向制备好的纤维蛋白-KGN 释放体系中加入凝血酶5 μL，形成凝胶状的KGN 释放体系，浸泡于含有10%FBS 的0.5 mL PBS 中，37 ℃摇床孵育，每24 h 更换1 次浸泡液，并用高效液相色谱法检测KGN 体外释放效率。

1.4 小鼠模型的构建及分组 采用随机数字表法将小鼠分为KGN 组和对照组，每组36 只。构建肩袖损伤修复小鼠模型，每只小鼠均接受单侧冈上肌腱分离和经骨修复，对照组在腱-骨修复部位应用纤维蛋白空载体系，KGN 组在腱-骨修复部位应用纤维蛋白-KGN 释放体系。单侧冈上肌修复术参考文献[8]，具体操作如下：使用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠；切开皮肤后，辨认并抬高肩峰，分离三角肌，暴露肩袖肌腱；分离冈上肌，双缝线穿过冈上肌腱，然后将冈上肌从其在肱骨头上的附着点分离，并使用解剖刀轻轻摩擦附着点；使用30G 针交叉钻孔，穿过先前备好的缝线；在重新附着肌腱前，在腱-骨界面涂抹按照上述1.3 中的方法构建的250 μL 纤维蛋白-KGN 释放体系（KGN 组）或250 μL 的纤维蛋白空载体系（对照组），等待10 s 使体系在体内凝血酶的作用下凝固，然后使用缝线固定KGN 释放体系，通过在肱骨近端皮质桥上打结缝合肌腱；逐层关闭切口，皮下注射0.05 mg/kg 丁丙诺啡止痛。术后皮下注射抗生素3 d，笼养，期间保证小鼠可在饲养环境中自由活动，术后4 周使用CO2处死小鼠并进行后续检测。

1.5 小鼠肩关节中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA相对表达水平检测 采用qRT-PCR 法。小鼠处死后，解剖肩关节，取肌腱及周围的骨和软骨组织，加入Trizol裂解，并在液氮中超声破碎组织。依次加入氯仿、异丙醇提取组织总RNA，并使用75%乙醇洗涤RNA 沉淀。使用反转录试剂盒合成cDNA，使用qRT-PCR 试剂盒检测肌腱重塑和成熟基因。反应体系：2×SYBR Green Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL，共20 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，随后95 ℃5 s 变性，60 ℃30 s 扩增，共循环40 次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，使用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达水平。qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.6 小鼠肩关节TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 蛋白表达检测 采用免疫组化染色。小鼠处死后解剖暴露肩部，去除多余组织，保留肱骨、肩胛骨、4 个相连的肩袖肌腱单位和喙肩弓，使用10%中性甲醛浸泡固定。依次使用乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，将蜡块切成5～8 μm 的薄片，45 ℃烘干。将切片置于二甲苯中脱蜡，然后使用高浓度到低浓度的乙醇梯度复水。使用3%H2O2孵育5～10 min，5%山羊血清孵育10 min封闭抗原。分别滴加TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 一抗工作液孵育2 h，然后滴加兔二抗工作液孵育30 min。滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，按照1 mL PBS+50 μL DAB 显色液A+50 μL DAB 显色液B 充分混匀配制DAB 显色剂工作液，滴加到切片上室温显色5～15 min。使用蒸馏水充分冲洗，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片，镜下观察并采集影像。

1.7 小鼠肩关节组织学观察 按照上述方法进行切片处理。采用HE 染色及阿尔新蓝染色观察纤维软骨面积时，使用苏木素染色10 min，蒸馏水洗去浮色后滴加伊红染色1 min，蒸馏水冲洗后阿尔新蓝染色10 min，冲洗、快速脱水、透明，中性树胶封固，镜下观察并采集影像。采用天狼星红染色观察胶原纤维密度时，使用天狼星红染色10 min 后，冲洗、快速脱水、透明，中性树胶封固、镜下观察结果。

1.8 统计学处理 采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KGN 体外释放结果 KGN-纤维蛋白体系中的KGN 可释放5 d，以前3 天为主，可释放（85.72±0.88）mg，占释放体系中KGN 总量的34.29%，见表2；释放量随时间递减，见图1。

图1 释放体系中KGN 总量百分比随时间变化的折线图

表2 KGN 体外释放实验结果

2.2 KGN 对小鼠肩关节中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA 相对表达水平的影响 与对照组比较，KGN组小鼠肩关节中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA相对表达水平均上调，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图2。

图2 两组小鼠肩关节中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 mRNA 相对表达水平比较

2.3 KGN 对小鼠肩关节中TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 蛋白表达的影响 与对照组比较，KGN 组小鼠腱-骨界面TNMD、PDGFAA、SOX9、SP7 蛋白表达增加，表明使用KGN 可上调腱-骨界面与肌腱、软骨和骨重塑相关的关键蛋白在组织局部的表达，见图3（插页）。

2.4 KGN 对腱-骨愈合端胶原纤维和纤维软骨生成的影响 术后4 周，HE 染色和阿尔新蓝染色显示，KGN组小鼠纤维软骨面积较对照组减小，见图4（插页）；天狼星红染色显示，KGN 组小鼠胶原纤维密度较对照组增加，见图5（插页）。结果表明，KGN 的使用抑制腱-骨愈合端纤维软骨的生成、促进胶原纤维的生成。

图4 KGN 对小鼠腱-骨愈合端纤维软骨生成的影响（A：对照组；B：KGN 组）

图5 KGN 对小鼠腱-骨愈合端胶原纤维的影响（A：对照组；B：KGN 组）

3 讨论

肩袖损伤修复后的腱-骨愈合对于临床医生和科研人员均具有一定的挑战性。尽管已研发多种生物材料、器械和术式以促进腱-骨愈合，但患者愈合失败的风险仍高达60%[9-10]。RCT 修复并非恢复生理状态下的腱-骨连接，而是以一种瘢痕介导的方式愈合，从肌腱过渡到未钙化的纤维软骨，再到钙化的纤维软骨，最后过渡到骨[11]。因此，改善腱-骨愈合的主要目标为减少修复部位未成熟的纤维、血管和组织，并重建肌腱附着点。既往研究通过动物RCT 模型检验了多种生物学强化方法，但大多通过添加生长因子以加速或加强肩袖修复，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子等，已被证实可改善小鼠或大鼠肩袖修复术后的组织学和生物力学特性[12-16]，但目前，该类方法的效果仍然有限。研究表明，KGN 可诱导间充质干细胞和肌腱干细胞向软骨分化，因而具有保护软骨、促进微骨折愈合、修补全层软骨缺损的潜力[6，17]，这在RCT 修复的腱-骨愈合过程中至关重要。因此，本研究构建纤维蛋白-KGN 释放体系，探究其促进肩袖损伤修复小鼠模型腱-骨愈合的作用及机制，以期通过KGN 的软骨诱导能力，更好地恢复肩袖的生理结构、强度和功能。

本研究构建的纤维蛋白-KGN 释放体系可释放5 d，前3 天可释放总量的34.29%，具有较高的释放效率。在肩袖损伤修复小鼠模型中，将纤维蛋白-KGN释放体系应用于腱-骨界面处，在4 周后修复的腱-骨界面的胶原纤维组织得到改善，KGN 可促进愈合处的结缔组织微结构成熟。这与此前报道的注射KGN-富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）的两项研究结果相一致[7，18]，研究发现KGN-PRP 组的肌腱移植物从骨隧道中的拔出强度显著高于PRP 组和0.9%氯化钠溶液对照组，KGN-PRP 注射治疗的动物腱-骨界面有排列良好的胶原纤维和成熟的软骨细胞，而PRP 和0.9%氯化钠溶液处理的肌腱胶原纤维组织较少、软骨细胞缺乏。与其他模型研究的结果一致，本研究发现应用KGN 可导致软骨形成、肌腱调节和成骨相关的基因和蛋白表达增加，提示KGN 可能促进骨生成、血管生成和肌腱的重塑与成熟。

与既往研究相反[19-20]，本研究发现，在KGN 处理的肩袖修复中，阿尔新蓝染色区域变小，纤维软骨生成减少。造成这种差异的原因可能是：（1）本研究使用的模型不同于该研究使用的跟腱穿孔活检模型，而是完全切断冈上肌腱在肱骨上的附着，模拟了急性全层冈上肌撕裂，如果不进行手术修复，几乎没有内在的愈合能力，在固有愈合能力较低的组织中，可能需要KGN 刺激外源性祖细胞以实现软骨生成，而跟腱具有更大的愈合潜力，因此修复部位有丰富的祖细胞[21]。（2）有证据表明，KGN 发挥治疗作用的分子机制具有组织特异性，在关节软骨中，KGN 可上转化生长因子-β/Smads 通路的表达[22]，但在人真皮成纤维细胞中，KGN 通过激活Smad4/5 通路增加Ⅰ型胶原的合成[23]，对于KGN 在肩袖发挥作用的分子机制尚需进一步的深入探索。（3）在本研究中，组织切片染色显示，与对照组相比，KGN 治疗导致愈合末端的细胞密度略有下降，祖细胞数量的减少可能导致KGN 无法诱导形成软骨样组织。因此，计划在接下来的研究中，进一步对KGN 促进RCT 修复后腱-骨愈合的分子通路进行挖掘，同时尝试补充局部祖细胞，进一步促进KGN 对局部愈合的疗效。

综上所述，纤维蛋白负载KGN 可以促进肩袖损伤修复小鼠模型腱-骨愈合。应用KGN 可导致软骨形成、肌腱调节和成骨相关的基因和蛋白表达增加，提示KGN 可能促进骨生成、血管生成和肌腱的重塑与成熟。KGN 的使用可促进腱-骨愈合端胶原纤维生成、抑制纤维软骨的生成，关于其分子机制，有待于未来的研究进一步探索。