LED 光源照射及PI3K 抑制剂对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

师若迪 徐晨 李娟 俞洋

光是生命活动所必需的，随着社会的发展，人造光的出现使人类在没有自然光的情况下依然能够继续进行社会活动[1]。LED 灯由于其优异的光照效率、低耗能、可控性强、使用便利、寿命长等诸多优点，已成为主流照明光源之一[2]。与传统照明灯相比，LED灯在较短的波长下可以发出更多的能量。随着LED灯的普及和越来越多的人暴露于LED 灯的时间延长，LED 光源能量会被更多的传输到视网膜上，对视网膜细胞造成的光化学损伤也相应增加[3]。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial, RPE）细胞是单层上皮细胞，分布于神经视网膜下方，它与光感受器和下面的脉络膜密切接触和相互作用，RPE 细胞在视网膜中具有多种功能，其中包括光感受器外节的吞噬作用[4]。研究表明光感受器变性是最常见的致盲原因之一，它可以导致视网膜病变和不可逆性的视力丧失[5]，加速遗传性疾病的发生，如年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）[6]。随着人口老龄化进程的加快，AMD 患病率呈现逐年上升趋势，预计到2040 年全球AMD 患病人数将增至2.88 亿[7]。AMD 是一种由多因素引起的视网膜神经退行性疾病，其中暴露在短波长的光下可能会导致该病的发生[8]。目前AMD 确切的发病机制尚不明确，已知自噬参与调控AMD 发病机制中的所有细胞死亡途径[9]，且光损伤是导致AMD 的重要危险因素[8]。为进一步探讨LED 光源照射及磷脂酰肌醇3 激酶（phosphaticylinositol 3-kinase，PI3K）抑制剂对RPE 细胞自噬和凋亡的影响，本研究使用PI3K 抑制剂LY294002 对RPE 细胞进行预处理，再观察RPE细胞的自噬和凋亡的变化，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器 人RPE 细胞ARPE-19（货号：iCell-h020，中国北纳生物公司）。FBS、DMEM/F12（货号：10099141、11330032，美国Gibco 公司）；红色荧光蛋白（monomeric red fluorescent protein，mRFP）-绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）-微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）双荧光质粒（货号：SGXM2022LA879，生工生物工程上海股份有限公司）；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（货号：C0009S，上海碧云天生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒（货号：BB-4101，上海贝博生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量试剂盒、全蛋白提取试剂盒（货号分别为P0100、89900，赛默飞世尔科技有限公司）；LY294002（规格：5 mg/瓶，货号：HY-10108，美国MCE公司）；Mouse Anti-LC3Ⅰantibody、LC3Ⅱantibody、苄氯素1（Beclin 1）antibody（货号分别为bsm-33309M、bs-4843R、bsm-33323M，北京博奥森生物技术有限公司）；SQSTM1/p62 antibody（货号：AF5384，中国Affinity公司）。TES-1332A 数位式照度计（中国台北泰仕电子工业）；酶标仪（型号：RT-6000，深圳雷杜生命科学股份有限公司）；分选型流式细胞仪（型号：BD FACS Aria Ⅱ，美国BD 公司）；透射电子显微镜（型号：JEM-1400Flash，日本电子株式会社）；奥林巴斯荧光倒置显微镜（型号：IX73，日本Olympus 公司）；奥林巴斯激光共聚焦显微镜（型号：FV3000，日本Olympus 公司）。

1.2 细胞培养 取3 代人ARPE-19 细胞复苏，配置含10% FBS、1%青霉素-链霉素的DMEM/F12 的完全培养基，将细胞种于25T 培养瓶，随后放进37 ℃、5% CO2培养箱中培养，间隔1～2 d 换液1 次，等到细胞融合度达到90%时消化细胞，进行1∶3 传代，取4～5 代对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞分组与人RPE 细胞光损伤模型的建立 体外培养人ARPE-19 细胞随机分为6 h 对照组、6 h 模型组、6 h LY294002 组，12 h 对照组、12 h 模型组、12 h LY294002 组，24 h 对照组、24 h 模型组、24 h LY294002组。对照组避光培养；模型组进行光照刺激；LY294002组中加入10 mmol/L LY294002 后进行光照刺激。将LED 冷光灯作为光源，悬挂在培养箱内顶端，垂直照射细胞，使用TES-1332A 数位式照度计监测光照强度，控制被照细胞光照强度在（16 500±500）lx 范围内，分别照射细胞6、12 和24 h。细胞在接受光照时，需要控制表面温度在36.5～37.5 ℃，以防止细胞光热损伤的发生。

1.4 细胞存活率检测 采用MTT 法。取对数生长期的ARPE-19 细胞用胰酶消化后，按每孔约5 000 个细胞密度接种于96 孔板中，细胞贴壁后，按照分组分别光照6、12 和24 h，光照结束后每孔加入10 mL MTT 溶液，培养箱内孵育4 h，吸取上清液后每孔加入100 mL Formazan 溶解液，继续培养箱内孵育4 h，显微镜下观察紫色结晶全部溶解，使用酶标仪测定570 nm 波长处吸光度值并计算细胞存活率。

1.5 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术。生长状态良好的ARPE-19 细胞按照分组处理并光照后，吸出旧液，用PBS 洗2 遍，用不含EDTA 的胰酶消化后收集各组细胞于离心管中，加冷PBS 洗涤细胞2 次，用400 mL Annexin V 结合液重新悬浮细胞，随后加入5 mL Annexin V-FITC 染色液，混匀后4 ℃避光孵育15 min，再加入5 mL PI 染液后避光孵育5 min，使用流式细胞仪检测。

1.6 细胞超微结构观察 采用透射电子显微镜。光照结束后收集各组细胞，2.5%电镜用戊二醛500 mL 避光固定，室温1 h，4 ℃冰箱放置3 h 后，吸出戊二醛，用冷PBS 洗3 遍，再4 ℃冰箱放置30 min。用1%锇酸固定1 h，PBS 洗2 次，通过梯度乙醇脱水，环氧树脂渗透包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，随后在透射电子显微镜下观察细胞超微结构。

1.7 双荧光mRFP-eGFP-LC3 质粒转染及自噬流变化观察 将mRFP-eGFP-LC3 双荧光质粒转染ARPE-19细胞中，感染48 h 后，400 倍激光共聚焦显微镜下观察红色和绿色LC3 的荧光点变化，随机选取一个视野下所有细胞进行拍照，分析自噬流变化。

1.8 细胞自噬相关蛋白Beclin l、LC3、p62 表达水平检测 采用Western blot 法。用蛋白裂解液提取各组细胞蛋白，利用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。通过计算机调整后变性，50 mg 上样，经SDS-PAGE 电泳后，用PVDF 转膜，加入一抗，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃封闭过夜，TBST 洗涤10 min 3 次，加入HRP 标记的二抗，暗室中加发光液并进行曝光。采用Image J 软件对蛋白条带进行灰度值分析。

1.9 统计学处理 采用Graphpad Prism 9.0 统计软件。计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05 为差异统计学意义。

2 结果

2.1 光照对ARPE-19 细胞存活率的影响 与对照组比较，6、12、24 h 模型组细胞存活率均下降（P＜0.05），12、24 h LY294002 组细胞存活率均下降（均P＜0.01）；与模型组比较，12、24 h LY294002 组细胞存活率均升高（均P＜0.05），见图1。

图1 光照6、12、24 h 后各组ARPE-19 细胞存活率比较

2.2 光照对ARPE-19 细胞凋亡率的影响 与对照组比较，6、12、24 h 模型组和LY294002 组细胞凋亡率均升高（均P＜0.05），且随时间增加细胞凋亡率增多；与模型组比较，6、12 h LY294002 组细胞凋亡率均下降（均P＜0.05），见图2。

图2 光照对ARPE-19 细胞凋亡率的影响（A：ARPE-19 细胞凋亡的流式图；B：各组ARPE-19 细胞凋亡率比较）

2.3 光照对ARPE-19 细胞超微结构的影响 与24 h对照组比较，24 h 模型组ARPE-19 细胞在经过光照24 h 后，胞内可见较多的自噬泡，LY294002 干预后也可见聚集性分布的自噬囊泡，提示光照诱导自噬发生，LY294002 可促进自噬的发生，见图3。

图3 光照24 h 后各组细胞超微结构比较（A：24 h 对照组；B：24 h 模型组；C：24 h LY294002 组）

2.4 光照对ARPE-19 细胞自噬流变化的影响 在光照6、12、24 h 后，对照组少见自噬溶酶体（红色亮点）。与对照组比较，模型组于光照6、12、24 h 后，红色亮点荧光亮度增加，且数量逐渐增多，Merge 图中从光照12 h 开始黄色亮点（自噬小体）数量增多明显，提示随光照时间延长，ARPE-19 细胞中的自噬溶酶体和自噬小体数量开始增加，说明光照可以促进自噬发生。同样，ARPE-19 细胞经LY294002 干预后，与对照组比较，红色亮点与黄色亮点呈增多趋势，说明LY294002 可以诱导自噬，见图4（插页）。

图4 光照对ARPE-19 细胞自噬流变化的影响

2.5 光照对APRE-19 细胞Beclin 1、LC3、p62 蛋白表达的影响 与对照组比较，6、12、24 h 模型组和LY294002组细胞中Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平均升高，p62蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与模型组比较，6、12、24 h LY294002 组细胞中Beclin 1、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达均升高，12、24 h LY294002 组细胞中p62 蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。提示随光照时间的递增，ARPE-19 细胞的自噬会加强，通过使用LY294002 干预后可能上调ARPE-19细胞自噬，见图5。

图5 光照对ARPE-19 细胞自噬相关蛋白的影响（A：电泳图；B：各组细胞Beclin 1 蛋白表达水平比较；C：各组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ相对蛋白表达水平比较；D：各组细胞p62 蛋白表达水平比较）

3 讨论

AMD 是一种引起黄斑区改变的复杂眼部疾病，黄斑区位于视网膜中部，主要负责中央和精细视力，AMD 会因为光感受器和RPE 细胞的功能下降或死亡而导致视力下降[10]。自噬是一种进化上保守的“自食”过程，在维持细胞内稳态方面起着至关重要的作用。在RPE 中，自噬是动态的过程，是由多种应激刺激引起的重要促进生存的一部分，光诱导损伤就是应激刺激之一，而自噬介导的降解可以是一种降低光吸收能力的手段，从而使光感受器细胞不被光诱导损伤[11]。本研究通过透射电子显微镜发现，给予一定时间的光照刺激后，RPE 细胞出现数量多的自噬囊泡，说明光照可诱导自噬的发生。

细胞自噬由自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）调控，LC3（ATG8）蛋白对自噬体的形成至关重要，是一种广泛使用的自噬泡标志物，最初在酵母中被发现，是吞噬细胞扩张和关闭所必需的。在自噬小体形成中，可溶性LC3Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合将所得LC3Ⅱ束缚在膜上。LC3Ⅱ独特地定位于自噬泡，从LC3Ⅰ到LC3Ⅱ的转换是吞噬泡关闭以产生自噬体的关键步骤[12]。LC3 的这种转化，可以通过荧光显微镜或Western blot 法进行观察和检测。除LC3 外，反映自噬的相关蛋白还有Beclin 1 和p62。Beclin 1 主要的功能是调节自噬，它参与自噬溶酶体形成的初始阶段，反映了自噬的诱导水平[13]。p62 作为另一个自噬标志物，可用于确定自噬状态。自噬激活与p62 蛋白的较低水平有关，而自噬抑制则与p62 的较高水平有关[14]。本研究采用将mRFP-eGFP-LC3 慢病毒质粒转染人RPE 细胞中，通过激光共聚焦显微镜观察光照后RPE 细胞自噬流的变化，结果发现，将光照时间延长后，mRFP 标记的LC3 的红色荧光亮点是逐渐增多的，mRFP 红色荧光与eGFP 绿色荧光融合形成的黄色荧光点的数量也是增多的，说明光照刺激自噬发生，且自噬流是通畅的。结合Western blot 自噬相关蛋白发现，经光照6、12、24 h 后模型组Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平均增加，p62 蛋白表达水平均减少，进一步反映了光照可诱导自噬的发生。

LY294002 是Ⅰ类PI3K 抑制剂，有研究表明抑制Ⅰ类PI3K 有助于自噬的启动[15-16]，提示LY294002 是自噬的关键调节因子。本研究使用LY294002 对RPE 细胞进行预处理，通过透射电子显微镜观察发现光照后RPE 细胞中可见聚集性分布的自噬囊泡；观察免疫荧光自噬流发现光照后红色亮点和黄色亮点呈递增趋势；Western blot 结果显示LY294002 组Beclin 1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ较对照组的表达水平增多，较模型组的表达水平也呈上升趋势，p62 的表达水平均呈递减趋势。表明LY294002 能够激活并上调自噬，这与前面的研究结果相符。

细胞凋亡是程序化细胞死亡的一种典型机制，在功能上不同于自噬，在许多细胞类型和疾病条件下，自噬的激活会抑制细胞凋亡介导的细胞死亡，而自噬的抑制会激活细胞凋亡过程[17]。然而，在特殊的情况下，细胞凋亡或坏死可能会受到自噬或自噬相关蛋白的诱导[18]。已知病理性的细胞凋亡与AMD 有关[19]。本研究发现RPE 细胞光照6、12、24 h 后，细胞凋亡率要比对照组细胞高，说明光照对RPE 细胞是有损伤的，在给予LY294002 干预后，RPE 细胞的凋亡率虽然较对照组的凋亡率高，但对比模型组的凋亡率要低，说明加入PI3K 抑制剂LY294002 后，RPE 细胞凋亡程度要轻于光损伤所造成的凋亡，这与其他学者的研究结果相类似[20-21]。此外，也有研究发现LY294002 既可以上调自噬水平，同时也可以诱导凋亡[22]。一般来说，相似的刺激似乎可以诱导细胞凋亡或自噬，有的时候虽然可检测到自噬和凋亡的混合表型对一些常见刺激的反应，但是在许多情况下，自噬和凋亡是以相互排斥的方式发展的，这可能是这两个过程可变阈值的结果，或者可能是与两种现象相互抑制有关的两种反应之间细胞“决定”的结果[23]。

综上所述，PI3K 抑制剂LY294002 对光照后RPE 细胞自噬和凋亡的影响，探讨了在LED 光源照射下RPE细胞的自噬和凋亡之间的关系，结果表明自噬对于AMD 的发生、发展是有一定调节作用的，通过上调自噬，能够延缓RPE 细胞由于应激刺激所造成的损伤。本研究希望能够为预防或治疗AMD 提供新的观点和研发思路。