针灸预处理对无水乙醇致急性胃黏膜损伤大鼠香草酸亚型1、降钙素基因相关肽蛋白表达的影响

兰永利 霍新慧 李盼 阿斯卡尔·牙生 韦芳

急性胃黏膜损伤又被称为应激性溃疡,通常是由于胃黏膜自身防御屏障功能被破坏下降而又被攻击因子刺激所致[1]。而酒精刺激是造成急性胃黏膜损伤的主要原因之一,酗酒或者过量饮酒会强烈刺激胃黏膜[2],而且乙醇导致急性胃黏膜损伤的发病率呈逐年上升趋势[3],对人们健康存在严重威胁。

中医自古以来就有“以人为本”“治未病”的思想,“治未病”指施以治疗手段防止疾病发生、发病之后防止发展,及时有效控制病情的发生发展[4],而国家积极倡导“健康中国”战略,把保障人民健康放在优先发展的位置[5],这与中医思想不谋而合,而针灸作为中医学的重要组成部分,以其绿色、简便、高效的治疗手段很容易被人们普遍接受。本课题组前期实验证明:针灸预处理能够加强胃黏膜微循环屏障,上调与屏障相关的保护因子,下调损伤因子,达到对胃黏膜组织的保护作用[6]。

香草酸亚型1(transient receptor potential vanillic acid subtype 1,TRPV1)是一种在细胞膜表面存在的阳离子通道蛋白,对维持胃黏膜稳态具有积极作用[7];降钙素基因相关肽(calcitonin gene and related peptide,CGRP)是一种生物活性多肽,可通过改善大鼠胃黏膜血流量,对乙醇诱导的胃黏膜损伤起到保护作用[8],而CGRP的合成分泌受到TRPV1调控。本研究通过观察大鼠TRPV1、CGRP蛋白表达水平的影响,探讨针灸预处理抗无水乙醇致急性胃黏膜损伤的可能机制,以便为应用于预防疾病提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雌雄各半大鼠52只,体质量(180～220)g,购自新疆医科大学动物实验中心,动物合格证号:SYXK(新)2018-0003。大鼠自由摄食、摄水,饲养室温度:20～25℃,相对湿度:50%～54%,自然昼夜交替。

1.2 药品与试剂

无水乙醇(天津市凯通化学试剂有限公司,执行标准:Q/STXH 286-2019),阿司匹林肠溶片(拜耳医药保健有限公司,规格100 mg×30片/盒,国药准字:J20130078),ELISA试剂盒名称:肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),上海优选生物科技有限公司(批号:YX-E21174 批次:202205);白细胞介素6(interleukin-6,IL-6),上海优选生物科技有限公司(YX-E21122 批次:202205);表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),上海优选生物科技有限公司(YX-E20968 批次:202205);三叶因子1(trefoil factor 1,TFF1),上海优选生物科技有限公司(YX-E28755 批次:202205)

1.3 主要仪器

一次性针灸针(华佗牌,规格0.25×13 mm),艾灸条(南阳汉医艾绒有限责任公司,规格4 mm×120 mm),固定支架(知福堂,蕲春上工记艾灸器具开发有限公司),酶标分析仪(型号:Infinite F50,上海优选生物科技有限公司),高速冷冻离心机(德国,型号:Eppendorf 5415C),分光光度计(日本,型号:SHIMAZDU UV-2540),蛋白印迹仪(台湾威泰克有限公司,型号:Yrdimes SW07D0567),台式恒温振荡器(中国上海精宏实验设备有限公司,型号:THZ-312),凝胶成像分析系统(台湾威泰克有限公司,型号:KETA M多用凝胶成像系统)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与干预方式 随机将大鼠分为四组:正常组、模型组、预灸组、预针刺组,每组13只。在适应性饲养7天之后,每日上午10:00开始进行实验操作。

腧穴的取穴依据《实验针灸学》常用动物穴位定位法进行确定[9]。正常组和模型组:艾灸支架固定,20分钟/次,不做处理,1次/天,连续7天。预灸组:艾灸支架固定,温和灸悬灸中脘、足三里(双),20分钟/次,1次/天,持续7天。预针刺组:艾灸支架固定,一次性针灸毫针针刺中脘、足三里(双),平补平泻,20分钟/次、1次/天,持续7天。每次处理结束之后,解除大鼠支架固定,回饲养室进行正常喂养。

1.4.2 造模 在预处理7天结束之后,第8天禁食不禁水,第9天开始对模型组、预灸组、预针刺组进行胃黏膜损伤模型的制备。应用动物实验室常用灌胃手法,采用无水乙醇与阿司匹林混悬液法灌胃制备模型,阿司匹林肠溶片与生理盐水(2 000 mg∶100 mL)配置成阿司匹林混悬液,先用无水乙醇0.6 mL/100 g进行灌胃,1小时后再予以阿司匹林混悬液200 mg/kg进行灌胃造模,造模4天。

1.4.3 标本采集 造模结束后,当天22:00禁食禁水,次日上午10:00开始取材。采用10%水合氯醛麻醉,起效后,腹主动脉取血,使用离心机离心后取上层血清。取完血后,统一解剖将全胃取出,在4%多聚甲醛中固定,用于指标检测。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况 对大鼠摄水摄食、毛发、大便、活动度,精神、体质量等一般情况进行观察[10],体质量每4天测量一次。

1.5.2 评定胃黏膜损伤指数(ulcer index,UI) 采用Guth PH等[11]的方法计算:将胃黏膜组织应用生理盐水冲洗干净,然后平铺于滤纸上,在10倍放大镜下,用肉眼观察,卡尺测量评估损伤程度:1分为损伤(包括糜烂点)不大于1 mm;2 mm≥损伤>1 mm为2分;3 mm≥损伤>2 mm为3分;4 mm≥损伤>3 mm为4分;损伤大于4 mm为5分;损伤宽度大于2 mm的时候计分加倍。UI评分为胃黏膜各处损伤计分后值的累加。

1.5.3 HE染色法观察胃黏膜组织病理变化 胃黏膜损伤指数评定完成之后,应用10 %多聚甲醛溶液对胃组织进行固定、脱水、石蜡包埋等常规操作,而后选取胃黏膜糜烂程度最明显地方切厚度为5 μm的薄片,之后进一步脱蜡脱水、HE染色,完成之后应用光学显微镜观察大鼠胃黏膜的病理变化(×400)。

1.5.4 ELISA法检测TNF-α、IL-6、EGF、TFF1浓度 腹主动脉取血,3 000 r/min离心20分钟,收集上清液,并在-80℃冰箱中储存待测。严格遵照ELISA试剂盒方法说明进行操作,计算TNF-α、IL-6、EGF、TFF1的浓度水平。

1.5.5 免疫组化法检测胃黏膜组织TRPV1、CGRP表达 取材结束后,每组随机选择5只大鼠,严格按照试剂盒方法进行操作,将常规石蜡包埋和组织切片经抗原修复后,用正常羊血清液封闭20分钟,将配置好的TRPV1、CGRP一抗工作液(1∶100稀释)滴加在组织上,4℃过夜,PBS洗涤后滴加生物素化第二抗体、辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP),DAB显色、复染、封片后,400×的显微照相,并进行图像分析。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

一般情况:预处理期间,四组大鼠摄水摄食及二便情况正常,毛发有光泽、灵活好动,精神良好。造模后,模型组大鼠摄水摄食量较前明显减少,大便夹有血丝,毛发暗淡,精神萎靡;预灸组和预针刺组大鼠较模型组情况有所改善。体质量比较:与造模前相比,各组大鼠针灸预处理后的体质量显著上升(P<0.05);与针灸预处理后相比,模型组和预针刺组大鼠体质量显著下降(P<0.05),而预灸组大鼠体质量显著上升(P<0.05);与预针刺组相比,预灸组大鼠体质量有所上升(P<0.05),提示艾灸效果强于针刺。如表1。

表1 各组大鼠在制备胃黏膜损伤模型前后体质量对比

2.2 各组大鼠UI评分

正常组胃黏膜组织表面光滑。与正常组相比,模型组胃黏膜组织表面出现显著出血灶,UI指数明显上升(P<0.01),提示模型制备成功;与模型组相比,预灸组和预针刺组胃黏膜组织表面只有少量出血灶,UI指数下降(P<0.01),提示针灸预处理对预防胃黏膜损伤有效;与预针刺组相比,预灸组UI指数下降(P<0.05),提示艾灸效果强于针刺。如图1,表2。

图1 胃黏膜组织在肉眼下的形态观察

表2 各组大鼠制备胃黏膜损伤模型UI评分比较

2.3 各组大鼠胃黏膜组织病理学形态变化比较

正常组大鼠胃黏膜组织未见病理改变,无渗出红细胞;模型组大鼠存在严重的胃黏膜损伤,有大量红细胞渗出;预灸组大鼠胃黏膜与正常组相似,未见病理改变;预针刺组大鼠胃黏膜大部分完整,只有少量红细胞渗出。如图2。

图2 各组大鼠胃黏膜组织病理学形态变化的比较(HE染色,×400)

2.4 ELISA法检测各组大鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、EGF、TFF1浓度水平的情况

与正常组相比,模型组TNF-α、IL-6浓度上升(P<0.05),EGF浓度下降(P<0.05),TFF1浓度有下降趋势,但无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,预灸组和预针刺组大鼠TNF-α、IL-6浓度下降(P<0.05),EGF水平上升(P<0.05),TFF1浓度有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05);与预针刺组相比,预灸组大鼠TNF-α、IL-6浓度下降(P<0.05),EGF水平上升(P<0.05),TFF1浓度有上升趋势,但无统计学意义(P>0.05)如表3。

表3 ELISA检测各组大鼠血清TNF-α、IL-6、EGF、TFF1浓度比较

2.5 免疫组化法检测针灸预处理对胃黏膜损伤大鼠TRPV1、CGRP蛋白表达的影响

与正常组比较,模型组大鼠TRPV1、CGRP蛋白表达水平上升(P<0.05);与模型组相比,预灸组和预针刺组大鼠TRPV1、CGRP蛋白表达水平下降(P<0.05);与预针刺组相比,预灸组大鼠TRPV1、CGRP蛋白表达水平下降(P<0.05)。如图3、4,表4所示。

图3 免疫组化法检测针灸灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠TRPV1蛋白表达的影响(×200)

图4 免疫组化法检测针灸预处理对急性胃黏膜损伤大鼠CGRP蛋白表达(×200)

表4 免疫组化染色显示各组大鼠胃黏膜组织中TRPV1、CGRP蛋白表达水平比较

3 讨论

急性胃黏膜损伤的临床表现为胃黏膜浅表性溃疡、糜烂或者出血[12],一般是由于胃黏膜受到攻击因子刺激使自我防御和修复功能遭到破坏。随着医疗、科学技术水平的不断提高,现代医学应用各种抑制剂药物治疗胃黏膜损伤已经取得不错效果,但随着人们养生意识的不断增强,“未病先防”思想越来越强烈,《素问·四气调神大论篇》提到“是故圣人不治已病治未病,不治已乱治未乱”,明确强调了“未病先防”的重要性[13]。而针刺和灸法较于中医其他手段来讲,其简便、安全、绿色的优点更容易被人们所接受,特别是灸法,孙思邈在《备急千金要方》中为其“治未病”奠定了理论基础[14]。

本研究采用胃经的合穴足三里和募穴中脘配合使用,以防止胃黏膜损伤的方法为“合募配穴[15]。急性胃黏膜损伤以其临床表现在中医学属于“胃脘痛”,为脾胃系统疾病[16],而足三里和中脘穴作为治疗脾胃系统疾病的常用穴位,相互配合使用,可激发胃气、调理中焦气机、祛邪扶正,调和阴阳。有研究表明,在治疗脾胃疾病方面,足三里、中脘运用频次最高,每一证型及症状均选取两穴为主穴[17]。

本文通过应用无水乙醇制备大鼠急性胃黏膜损伤模型,为防止大鼠胃黏膜损伤后的自愈,1小时后给予阿司匹林混悬液灌胃。大量饮酒后,乙醇代谢不及时,在胃内潴留,刺激胃黏膜,降低胃黏膜自我修复因子的保护作用,并显著影响胃黏膜的生理功能[18]。在本次实验取胃黏膜组织后,与正常组对比,模型组大鼠肉眼观察下的胃黏膜组织出血、糜烂明显,且HE染色发现胃黏膜上皮细胞固有层充血、出血明显,提示大鼠无水乙醇致急性胃黏膜损伤模型制备成功。

TNF-α、IL-6是常见的炎症因子,其浓度水平上升提示炎症反应,胃黏膜组织遭到破坏。EGF可促进细胞再生能力,提高胃黏膜自我防御,TFF1主要在胃黏膜表面表达,可促进黏膜的再生与修复[19],其浓度下降表明是胃黏膜发生了病理性改变。TRPV1可参与炎症反应的发生,在胃黏膜损坏发病机理中至关重要。CGRP是重要的具有负向调节功能的免疫调节肽[20]。本实验研究中,与正常组相比,模型组大鼠TNF-α、IL-6水平上升,EGF、TFF1水平下降,TRPV1、CGRP蛋白表达水平上升;与模型组相比,预灸组和预针刺组大鼠TNF-α、IL-6水平下降,EGF、TFF1水平上升,TRPV1、CGRP蛋白表达水平下降;与预针刺组比较,预灸组大鼠TNF-α、IL-6水平下降,EGF、TFF1水平上升,TRPV1、CGRP蛋白表达水平下降,提示针刺和艾灸预处理可通过调控TRPV1、CGRP蛋白表达水平,降低炎性因子浓度,提高抗炎因子浓度,从而增强胃黏膜的自我修复和防御能力,减轻胃黏膜的损伤程度。艾灸预处理效果强于针刺预处理。

综上所述,应用针灸预处理“治未病”可预防胃黏膜损伤,进而减轻由胃黏膜损伤引发的消化系统其他病症,作用机制可能是通过影响TRPV1、CGRP蛋白表达水平来实现的,可为临床预防胃黏膜损伤提供理论基础,但是针灸预防胃黏膜损伤还有其他作用机制,需要进一步进行实验探讨。