HIF-3α蛋白检测在子宫内膜病变筛查中的应用价值

张静芳 易嘉升 陆宝明

【摘要】目的：探讨缺氧诱导因子-3α（Hypoxia inducible factor-3α，HIF-3α）检测在子宫内膜病变筛查中的应用价值。方法：收集于本院就诊的女性因良性疾病切除子宫患者的正常内膜组织、子宫内膜癌组织及癌旁组织标本，其中正常内膜组织、子宫内膜增生、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌、子宫内膜非腺癌标本各16例。免疫组化实验检测正常子宫内膜组织、子宫内膜增生和不典型增生组织以及子宫内膜腺癌组织和子宫内膜非腺癌组织中HIF-3α蛋白的表达。Western blot检测比较各组织HIF-3α表达情况。結果：与正常内膜组织相比，子宫内膜增生癌变后HIF-3α的表达显著增多，其中子宫内膜不典型增生组织内HIF-3α表达量最多，而子宫内膜腺癌与子宫内膜非腺癌组织内无明显差异。结论：HIF-3α蛋白检测可作为临床子宫内膜病变筛查过程中的重要依据。

【关键词】HIF-3α蛋白；子宫内膜病变；筛查

基金项目：广东省医学科学技术研究基金项目《HIF3α蛋白在不同子宫内膜病变中的表达》（B2021277）

Application value of HIF-3α protein detection in screening of endometrial lesions

ZHANG Jingfang， YI Jiasheng， LU Baoming

East Guangdong Hospital， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Meizhou， Guangdong 514000， China

【Abstract】Objective：To investigate the application value of Hypoxia inducible factor-3α （HIF-3α） detection in screening of endometrial lesions. Methods：The specimens of normal endometrial tissue， endometrial carcinoma tissue and paracancer tissue were collected from women who underwent hysterectomy due to benign diseases. There were 16 specimens of normal endometrial tissue， endometrial hyperplasia， endometrial atypical hyperplasia， endometrial adenocarcinoma and endometrial non-adenocarcinoma respectively. The expression of HIF-3α protein in normal endometrial tissue， endometrial hyperplasia and atypical hyperplasia tissue， endometrial adenocarcinoma tissue and endometrial non-adenocarcinoma tissue was detected by immunohistochemical assay. Western blot analysis was performed to compare HIF-3α expression in different tissues. Results： Compared with normal endometrial tissues， the expression of HIF-3α increased significantly after endometrial hyperplasia， and the expression of HIF-3α was the highest in endometrial atypical hyperplasia tissues， while there was no significant difference between endometrial adenocarcinoma and non-endometrial adenocarcinoma tissues. Conclusion：The detection of HIF-3α protein can be used as an important basis for clinical screening of endometrial lesions.

【Key Words】HIF-3α protein； Endometrial lesions； Screening

癌细胞可以利用氧气稳态系统驱动癌症进展，缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factors，HIF）是调节氧气稳态的主要因子之一，负责与成年人体内50万亿个细胞中的每一个细胞的氧气供需相调试，在这个过程中，HIFs 激活数千个基因的转录，这些基因转录过程中激活或者介导血管生成、癌症干细胞生成、细胞运动、上皮-间质转化、细胞外间质重塑、葡萄糖和脂类代谢、免疫逃避、细胞侵袭和转移等。其中在转录水平上，维持氧稳态的重要节段是如何利用缺氧诱导因子（HIFs）的作用，以及为了响应降低的氧可用性HIFs介导的每个细胞如何转录程序进行重排。缺氧诱导因子是细胞应对缺氧状态的关键因子。

HIF是α/β异二聚体的转录因子，主要调节细胞对低氧环境的反应，在三种HIF-α亚型中，HIF-3α与HIF-1α和HIF-2α在蛋白质结构和基因表达调节方面不有所不同，并且长期以来，HIF-3α被认为是HIF调控基因的负调控因子并且具有转录调控功能，在缺氧时与HIF-1和HIF-2竞争结合靶基因中的转录元件，从而对基因表达产生负面影响。缺氧诱导因子的活化随后诱导下游靶基因，导致一系列反应，由此产生的异常过程或代谢产物反过来影响缺氧诱导因子的稳定性。鉴于HIFs在肿瘤进展中的作用，HIFs已被认为是提高治疗效果的治疗靶点。目前已知，HIF-1和HIF-2作为缺氧转录反应的主要调节因子发挥作用，HIF-3α是迄今为止研究最少的一种。

通过美国癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析，高突变负荷组子宫内膜癌组织中HIF-3α突变显著，提示其可能在子宫内膜癌发生发展中发挥重要作用。子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，是发展中国家发病率最高的妇科恶性肿瘤，但其具体发病机制目前仍不十分清楚，在鉴别诊断过度增生和高分化子宫内膜癌的组织学研究中仍然存在争议，利用现有的标记物来预测非典型子宫内膜癌患者是否过度增生尚不可靠[1]。研究发现子宫内膜增生主要是指子宫内膜内腺体的过度增生，会导致腺体与基质的比例过高，这一细胞学异型性，可能进展为与子宫内膜癌和其他病理变化共存，在子宫内膜过度增生或癌症中表达改变的生物标志物，如孕激素受体、胰岛素样生长因子、视黄醛去氢酶II型和分泌的卷曲相关蛋白4，似乎均有望用作早期肿瘤标志物，然而如何通过早期肿瘤标志物的检测进而尽早阻断子宫内膜疾病的发生发展仍然有待研究[2]。本研究拟通过免疫组化和Western blot检测不同子宫内膜病变组织中HIF-3α蛋白的表达情况，对发现其潜在的分子机制和新型分子靶标应用于子宫内膜癌的早期诊断有重要意义。

1.1 一般资料

使用G.Power软件估计样本量，取α=0.05，1-β=0.8，算得免疫组化需要总标本80例，Western blot需要总标本42例。选取正常内膜组织、子宫内膜增生、子宫内膜不典型增生、子宫内膜腺癌、子宫内膜非腺癌标本各16例，术中取出组织后，在无菌条件下将组织置于福尔马林浸泡（浸泡时间>12h），组织石蜡包埋，制成蜡块，经病理确诊后用于IHC检测；选取女性因良性疾病切除子宫患者的正常内膜组织、子宫内膜癌组织及癌旁组织作为标本，术中取出标本后，在无菌条件下放入液氮盒中冻存，并保存在-80℃冰箱中，使用Western blot法检测HIF-3α表达情况。

1.2 实验试剂

鼠抗人HIF-3α单克隆抗体由美国Abcam公司提供；免疫组化S-P试剂盒由福州迈新生物技术开发公司提供；DAB酶底物显色剂由碧云天生物科技公司提供；GAPDH一抗、HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG购自碧云天生物技术公司；HIF-3α抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 2.实验方法

1.2.1 免疫组化实验

造模结束后将各组织进行固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片。采用免疫组化S-P法进行染色，染色步骤按照试剂盒要求进行。阳性对照：已知鼠抗人HIF-3α单克隆抗体表达阳性的内膜组织；阴性对照：PBS代替一抗。

1.2.2 Western blot实验

每例标本取组织约50mg，加入细胞裂解液、研磨、离心，通过试剂盒检测各组蛋白样品的浓度。使用SDS-PAGE 在电泳液中分离。电泳通过SDSPAGE分离各组蛋白样品，电泳结束后在200mA恒流条件下在转移液中将各组蛋白转移至PVDF膜上，转膜结束后PBS洗涤，后将膜在封闭液中室温封闭1h左右，封闭结束后PBS洗涤，后将膜与稀释后的Gli-1和Shh抗体在4℃冰箱中孵育过夜。孵育结束后TBST洗涤，室温下将膜与稀释后的山羊抗兔IgG孵育1h左右，最后通过显影仪显影并用ImageJ进行灰度值分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。计数资料采用（%）表示，进行x2检验，计量资料采用（x±s）表示，進行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2.1 免疫组化（IHC）检测HIF-3α蛋白表达情况

采用IHC法对16例人子宫内膜癌组织及周围组织的石蜡包埋切片进行HIF-3α蛋白检测。HIF-3α蛋白在子宫内膜不典型增生状态下表达量明显最多，略高于子宫内膜癌，明显高于正常内膜组织以及子宫内膜增生组织。而子宫内膜腺癌与非腺癌标本中，并未发现太大差异。（图1）

正常子宫内膜；（b）子宫内膜增生；（c）子宫内膜不典型增生；（d）子宫内膜腺癌；（e）子宫内膜非腺癌

有研究表明，当HIF-α异二聚体在低氧条件下处于稳定状态时可以执行转录活性。HIF-1α和 HIF-2α异源二聚体是产生基因活化的主要转录因子，这些基因在其启动子序列中含有缺氧反应元件。癌细胞中HIF-α靶基因的活化可促使新陈代谢过程中发生氧化磷酸化、糖酵解、生存活化、血管生成、转移和增殖路径。虽然过去的大部分研究集中在不同类型癌症中HIF-1α和HIF-2α活性的重要性，但很少有数据可以充分解释不同类型癌症中HIF-3α表达水平和分子活性的重要性。HIF-3α含有ODD结构域，可以在低氧条件下稳定与 HIF-β亚单位竞争二聚化来限制HIF-1α和HIF-2α的活性，目前已证明HIF-3α蛋白在肝脏、胃、大肠中都有表达，此外在正常细胞和缺氧细胞中也均有表达，并且其分布并不局限于细胞核中，在细胞胞浆中也有少量的表达，若将细胞保持在缺氧状态下，HIF-3α蛋白的表达会明显增加。尽管HIF-3α已经显示出组织特异性的表达模式，但是它在许多类型的癌症中的确切表达模式仍然是未知的[3]。

因此有研究对HIF-3α蛋白对靶细胞的侵袭和迁移能力做了相关实验，临床研究发现，胰腺癌患者体内 HIF-3α蛋白表达水平越高，其生存率反而降低，进一步检测发现HIF-3α蛋白表达升高时，癌细胞的局部侵袭和远处转移的能力明显增强。而在动物实验中研究人员发现在缺氧条件下，敲除HIF-3α后能够明显抑制小鼠体内胰腺癌细胞的生物学行为。当HIF-3α过表达时能够明显促进小鼠体内胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。在近年的文献报道中，实验人员发现HIF-3α促进胰腺癌细胞生物学行为的过程可能与 RhoCROCK1信号通路的调控有关。此外，研究已证明HIF-1α和HIF-2α可能在肺缺氧适应过程中起作用，但HIF-3α联合血管内皮生长因子（VEGF）可能在心脏对缺氧的反应中起重要作用[4]。本研究中关于HIF-3α蛋白在子宫内膜癌病变发展中的表达发现，子宫内膜癌变时的HIF-3α蛋白表达明显大于正常内膜组织以及子宫内膜增生组织，其中子宫内膜不典型增生状态为HIF-3α蛋白的最高峰，略高于子宫内膜癌，明显高于正常内膜组织以及子宫内膜增生组织。

综上所述，HIF-3α蛋白与子宫内膜病变的之间存在一定相关性，当细胞处于不典型增生状态时HIF-3α蛋白为高表达状态，子宫内膜腺癌与非腺癌标本总体HIF-3α蛋白表达量大于正常内膜以及子宫内膜增生状态。这为后续发现其潜在的分子机制和新型分子靶标应用于子宫内膜癌的早期诊断有重要意义。

参考文献

[1] 陈姝宁，孔为民.子宫内膜癌规范化治疗与新进展[J].中国临床医生杂志，2023，51（3）：263-267.

[2] 郄伟，李俊魁.子宫内膜采集器在子宫切除前子宫内膜病变筛查中的应用[J].中国医疗器械信息，2023， 29（10）：142-144.

[3] 王伟旭.子宫内膜病变的超声诊断价值及影像特征分析[J].现代诊断与治疗，2021，32（23）：3817-3819.

[4] 张丹，孙大光，张璐，等.低氧诱导因子-3α对胎盘滋养层细胞生长的影响[J].生殖医学杂志，2021，30（4）：507-515.