激光雕刻石墨烯阵列电极测定曲美他嗪

刘凌波 李 双 吴康兵，2*

（1华中科技大学化学与化工学院， 武汉 430074）

（2湖北大学健康科学与工程学院， 武汉 430062）

曲美他嗪（Trimetazidine， TMZ）是一种广泛使用的冠状动脉扩张药物，在心力衰竭和心绞痛的临床治疗上有显著的疗效［1-2］。然而它却被列入《世界反兴奋剂条例》的禁用清单，成为体育赛事禁用的物质［3］，由其引起的禁赛风波也是屡见不鲜［4］。因此，开展灵敏、快速简便的曲美他嗪检测新方法研究具有重要意义。电化学测量具有操作简单、灵敏度高、成本低和易实现在线现场检测等特点［5-6］，然而目前关于曲美他嗪的电化学检测研究还较少［7］，采用三电极一体化的阵列电极对其进行检测更是少见。

在激光照射下，芳香族碳质前体可吸收的光子能量引起晶格振动，极高的局部温度使C—O、C= = O和N= = C 键在高温下分解［8］。这些原子重新组合成小分子（CO、CO2、HCN 和C2H2）释放出来，而剩余的芳香族化合物碎片则被重新排列形成石墨烯结构［9-10］。目前，报道的碳质前体包括多种合成聚合物（如聚酰亚胺［11］、聚四氟乙烯［12］和聚醚砜［13］等）和天然材料（如木材［14］、木质素［15］和食物［16］）等，因此该技术被认为是一种极具成本效益且环境友好的工艺。本文以聚酰亚胺薄膜为碳质前体，通过激光雕刻技术并结合图案化设计成功制备出石墨烯一体化电极阵列。研究了激光功率对石墨烯电极的结构形貌、活性面积、电荷转移能力以及对曲美他嗪氧化增敏效应的影响。基于激光雕刻石墨烯阵列电极显著的信号放大效应，建立了一种灵敏、简便的曲美他嗪电化学检测新方法，并成功用于人体尿液样品分析。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

CHI 660E型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；总功率为15 W 的L1型聚焦迷你激光机（上海雕途实业公司）；KQ-50B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LabRAM HR800型激光共焦拉曼光谱仪（法国Horiba JobinYvon 公司）；Nova Nano SEM 450型扫描电子显微镜（SEM，荷兰FEI公司）。

曲美他嗪盐酸盐（＞95%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。聚酰亚胺胶带、特氟龙胶带和聚对苯二甲酸乙二醇酯薄板购于深圳市新宏森科技有限公司。Ag/AgCl 浆购于上海聚隆电子科技有限公司。铁氰化钾（K3［Fe（CN）6］）、氯化钾（KCl）、十二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、尿酸、抗坏血酸、尿素和葡萄糖均为分析纯试剂，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 一体化阵列电极的制备

首先，绘制一体化阵列电极的图案并导入激光雕刻机中，设置为雕刻图像。如图1A所示，阵列的工作电极是一个直径3 mm 的圆，参比电极（左侧）和对电极（右侧）是扇形环，阵列下半部分的长条状用于与电化学工作站电极线之间的连接。随后，将聚酰亚胺（PI）胶带均匀紧密地粘贴在聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄板上，置于激光雕刻机下（图1B）。调节雕刻深度（4%）和激光功率（50%、60%、70%和80%），经雕刻后即可得到一体化石墨烯阵列电极（图1C）。这里的深度指的是机器的理论加工厚度，即激光诱导石墨烯表面到PI基质的距离，但实际的深度往往与材质和功率有关。不同雕刻功率下制备的电极分别命名为LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 阵列，如图1D 中的操作所示，使用数字万用表对4 种阵列的左侧列进行电阻的测量与记录。之后，对阵列进行封装。将特氟龙疏水胶带与圆相切粘贴在阵列上，以分开连接传感区域和电极连接区域，再使用极细的软毛刷将Ag/AgCl浆涂覆在阵列的参比电极上（图1E），干燥剪切后即可使用。阵列与电化学工作站之间通过定制的电极夹连接。如图1F 所示，将金属尖头与阵列的三电极对准夹紧，再将工作站与电极夹上的三根导线连接即可进行电化学测试，操作十分简便。

图1 （A）一体化阵列的设计图像； （B）激光雕刻过程； （C）激光雕刻后的一体化阵列； （D）一体化阵列的电阻测量； （E）封装并涂覆了Ag/AgCl浆的一体化阵列电极； （F）一体化阵列与电化学工作站之间的连接方式Fig.1 （A） Design image of the integrated arrays； （B） Process of laser engraving； （C） Integrated arrays after laser engraving； （D） Resistance measurement of integrated arrays； （E） Integrated arrays after encapsulation and coating with Ag/AgCl slurry； （F） Connection between the integrated array and the electrochemical workstation

2 结果与讨论

2.1 表征与分析

用拉曼光谱对雕刻后的一体化阵列电极进行了表征。如图2 所示，4 种阵列均可以观测到石墨烯的3 个特征峰［17］，分别是D 峰（1358 cm-1）、G 峰（1589 cm-1）和2D 峰（2704 cm-1），而聚酰亚胺（PI）本身并无这些特征峰的出现。这表明经激光雕刻后，成功生成了石墨烯。另外，通过D 峰与G 峰的强度比（ID/IG）来评估了石墨烯的缺陷水平［18］。LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 的ID/IG值分别为0.45、0.37、0.19 和0.24。当激光功率太低时，会产生部分无定形碳，从而导致石墨化程度较低，缺陷含量较高［19］。因此，当功率由50%升高至70%时，石墨化程度逐渐提升，缺陷含量逐渐降低。而当功率过高时，会引起热辐射区能量增加，石墨烯会在瞬时的高温下发生局部氧化甚至结构的坍塌，最终导致缺陷含量反而升高。

图2 PI、LIG-50、LIG-60、LIG-70和LIG-80的拉曼光谱Fig.2 Raman spectra of PI， LIG-50， LIG-60， LIG-70 and LIG-80

用SEM 观察了4 种阵列电极的平面/截面形貌。图3A-3D 为雕刻后阵列电极的低分辨率俯视SEM图像，可观察到石墨烯整体沿着激光的雕刻路线产生，呈条纹状。随着激光功率的升高，阵列表面的结构愈发疏松，孔状结构也更细密。这是因为激光聚焦导致局部温度瞬间上升，释放出了部分气体产物形成了多孔蓬松结构［20］。为了观察石墨烯的精细结构，图3E-3H 给出了阵列电极的高分辨俯视SEM 图，清楚地观察到与石墨烯二维结构相符的多层卷曲结构。当激光功率从50%上升至70%时，石墨烯片层逐渐变大且更趋于完整，表明雕刻功率直接影响了碳化程度和片层结构。而当功率继续提升至80%时，石墨烯片层出现了溅射的小颗粒结构，可能是由于石墨烯片层在该功率下遭到了部分破坏。

图3 （A、E） LIG-50 阵列、（B、F） LIG-60 阵列、（C、G） LIG-70 阵列和（D、H） LIG-80阵列的俯视SEM图像Fig.3 Top-view SEM images of （A， E） LIG-50 array， （B， F） LIG-60 array， （C， G） LIG-70 array and （D， H）LIG-80 array

进一步从横截面观察了激光功率的影响。如图4 所示，激光诱导后PI 表面产生了疏松多孔结构的石墨烯。经测量，LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 层厚度分别为19.18、32.35、36.01 和46.10 μm，而LIG-80 层厚度的骤然提升可能与疏松程度有关。另外，还观察到激光功率的变化使得石墨烯与基质之间的间隙逐渐增大，这极易造成石墨烯脱落，从而影响阵列电极的性能。

图4 （A） LIG-50 阵列、（B） LIG-60 阵列、（C） LIG-70 阵列和（D） LIG-80 阵列的横截面SEM图像Fig.4 Sectional-view SEM images of （A） LIG-50 array， （B） LIG-60 array， （C） LIG-70 array and （D） LIG-80 array

2.2 电化学性能测试

以K3［Fe（CN）6］为探针，利用循环伏安法（CV）测定了4种阵列电极的活性面积。如图5A-5D 所示，观察到一对比较对称的氧化还原峰，随扫速的增加，峰电位变化较小，而氧化峰电流（Ipa）随扫速的平方根（ν1/2）线性增加（图5E）。通过Randles-Sevcik 方程［21］，得到LIG-50、LIG-60、LIG-70 和LIG-80 阵列电极的活性面积（A）分别为0.118、0.122、0.138和0.134 cm2。由此可见，激发功率（P）为70%制备的阵列电极的有效面积较大，这可能与其特殊的结构有关。此外，还测量了4种阵列电极的电阻。如图5F所示，激光功率越大，得到的阵列电极的电阻越小。虽然80%激光功率下得到的阵列电极的电阻更低，但由于石墨烯片层更蓬松易脱落，我们仍倾向于选择70%功率下制备的阵列电极（LIG-70）。

图5 不同扫速下5 mmol/L K3［Fe（CN）6］在LIG-50阵列（A）、LIG-60阵列（B）、LIG-70阵列（C）和LIG-80阵列（D）上的CV 曲线； （E）不同阵列电极上的Ipa-v1/2曲线； （F）阵列电极的电阻随激光功率的变化（误差棒为3 次测量结果的标准偏差）Fig.5 CV curves of 5 mmol/L K3［Fe（CN）6］ on （A） LIG-50 array， （B） LIG-60 array， （C） LIG-70 array and （D） LIG-80 array at different scan rates；（E） The plots of Ipa-v1/2 on different arrays； （F） Resistance changes of different arrays with laser power （error bars represent the standard deviation of three measurements）

为了筛选出电化学性能最优的阵列，研究了曲美他嗪在不同石墨烯阵列电极上的阻抗。如图6A所示，在0.1 mol/L，pH=6.5 的磷酸缓冲溶液中，0.5 mmol/L 曲美他嗪在4 种石墨烯阵列电极上的Nyquist图谱均出现一个较大的半圆。Nyquist图中圆弧的直径代表电荷转移电阻（Rct），直径越大，Rct越大，电荷转移能力就越低。通过内插图的Randles等效电路拟合得到，LIG-50、LIG-60、LIG-70和LIG-80阵列电极的Rct值分别为17.5、16.6、14.7和15.8 kΩ。随着激光功率的增大，制备出的石墨烯阵列电极的电荷转移能力越强。而LIG-80阵列的Rct略大于LIG-70阵列，可能与石墨烯片层被部分破坏有关。

图6 （A） 0.5 mmol/L 曲美他嗪在不同阵列电极上的Nyquist 图，偏压： 0.55 V，频率范围： 0.03～10000 Hz，内插图为Randles等效电路，其中Rs、CPE、Rct和Zw分别代表溶液电阻、常相位角元件、电荷转移电阻和Warburg阻抗。（ B） 10 μmol/L曲美他嗪在不同阵列电极上的LSV曲线Fig. 6 （A） Nyquist plots of 0.5 mmol/L TMZ on different arrays； Bias voltage： 0.55 V， Frequency range： 0.03～10000 Hz； Inset： the Randles equivalent circuit （Rs， CPE， Rct and Zw represent the solution resistance， constant phase angle element， charge transfer resistance and Warburg impedance）.（B） LSV curves of 10 μmol/L TMZ on different arrays

用线性扫描伏安法（LSV）研究了曲美他嗪在4 种阵列的氧化信号。如图6B 所示，阵列电极在0.10 mol/L，pH=6.5 的磷酸盐缓冲溶液中的曲线非常平滑（虚线）； 当加入10 μmol/L 曲美他嗪后则在0.61 V 出现一个氧化峰（实线）。比较发现，曲美他嗪在LIG-70 阵列电极上的氧化信号最强。综上所述，激光雕刻功率对石墨烯阵列电极的电化学性能有明显影响，当激光功率为70%时制备得到的石墨烯阵列电极（即LIG-70）的有效面积较大，电子交换能力更强，对曲美他嗪的氧化增强效应也更加显著。

用CV 研究了不同扫速下曲美他嗪在LIG-70阵列电极上的电化学行为。如图7A 所示，曲美他嗪在0.10 mol/L，pH=6.5 磷酸盐缓冲溶液中只出现一个氧化峰，峰电流随扫速线性增加（内插图），而氧化峰电位随扫速增加而逐渐正移，并且峰电位（Epa）与扫速的自然对数lnv呈现良好的线性关系（图7B）。这说明曲美他嗪的氧化是吸附控制的不可逆过程。根据Epa-lnv曲线的斜率和Laviron公式（公式（1））：

图7 （A）不同扫速下20 μmol/L 曲美他嗪在LIG-70 阵列上的CV 曲线，内插图为Ipa-v 曲线； （B） Epa-ln v 曲线；（C） 20 μmol/L曲美他嗪在不同pH值磷酸盐缓冲溶液中的CV曲线，扫速为100 mV/s； （D） Epa-pH曲线Fig.7 （A） CV curves of 20 μmol/L TMZ on LIG-70 array at different scan rates， inset： Ipa-v plot； （B） Plot of Epa-ln v；（C） CV curves of 20 μmol/L TMZ in phosphate buffer with different pH values on LIG-70 array at a scan rate of 100 mV/s；（D） Plot of Epa-pH

式中，K为常数，α是电子转移系数，n是电子转移数，v是扫速，F是法拉第常数，R是气体常数，T是绝对温度，可计算出参与氧化过程的电子数为2。进一步研究了曲美他嗪在0.10 mol/L，不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中的电化学行为。从图7C可知，Epa随pH值增大而负移，说明其氧化过程有质子参与。如图7D所示，Epa-pH 曲线的斜率为-0.051 V/pH，与等电子质子转移时的理论值-0.059 V/pH 十分接近，因此表明相同数量的质子和电子参与了曲美他嗪的氧化。因此，曲美他嗪的氧化是一个2电子、2质子过程，与文献［22-23］报道结果相符。

2.3 曲美他嗪的检测

为了获得更高的响应信号，分别考察了缓冲溶液pH值（图8A）、初始电位（图8B）和富集时间（图8C）对曲美他嗪在LIG-70阵列电极氧化峰电流的影响，获得了如下的最佳测定条件： pH=6.5，初始电位为0 V，富集时间为6 min。在最佳测试条件下，考察了不同浓度的曲美他嗪在阵列电极上的响应情况。如图8D所示，当没有曲美他嗪时，未出现氧化峰； 当加入不同浓度的曲美他嗪后，出现一个明显的氧化峰，峰高随浓度增加而逐渐提高。图8E 给出了标准曲线，发现曲美他嗪的氧化峰电流（Ipa）与其浓度（c）在0.5～20 μmol/L 的范围内呈现很好的线性，线性回归方程为Ipa（μA）=2.00c（μmol/L），相关系数（r）为0.9998。基于3倍信噪比计算得到的检出限为0.15 μmol/L。

图8 （A） pH 值、（B）初始电位和（C）富集时间对5 μmol/L 曲美他嗪氧化峰电流的影响；（ D）不同浓度的曲美他嗪在LIG-70 阵列电极上的LSV 曲线；（ E）曲美他嗪的标准曲线；（ F）曲美他嗪及与干扰物共存时的响应信号。误差棒均为3次测试结果的标准偏差Fig. 8 Effects of（ A） pH values，（ B） initial potential and（ C） accumulation time on the oxidation peak current of 5 μmol/L TMZ；（ D） LSV curves of TMZ with different concentrations on LIG-70 array；（ E） The calibration curve of TMZ； （F） Response siganls of 5 μmol/L TMZ in the absence and in the presence of interfertants. The error bars represent the standard deviations of three measurements

考察了尿液中可能存在的物质对曲美他嗪测定的影响，结果见图8F所示。发现5 μmol/L曲美他嗪单独存在时的氧化信号与400 μmol/L抗坏血酸（AA）、1 mmol/L尿素（UR）、40 μmol/L尿酸（UA）、5 mmol/L葡萄糖（GLU）共同存在时的氧化信号相比改变很小（＜5%），表明制备的阵列电极有较好的抗干扰能力，在尿液分析中有较好的应用前景。

将采集的3 份健康志愿者的尿液用0.10 mol/L，pH=6.5 的磷酸盐缓冲溶液稀释5 倍后直接进行测定。均未检出曲美他嗪，于是进行了加标回收实验。每个样品平行测定3次，相对标准偏差（RSD）低于2%，说明重现性好。测定结果如表1所示，加标回收率在96.0%～106.2%范围内，说明阵列电极有较高的准确度和较好的实用性。

表1 尿液中曲美他嗪的测定 （n=3）Table 1 Determination of TMZ in urine samples from volunteers （n=3）

3 结 论

首先，对聚酰亚胺胶带进行图案化设计出阵列电极，然后，借助激光雕刻简便地制备出一体化石墨烯阵列电极。当激光功率从50%增加到70%时，制备的石墨烯阵列电极的有效面积和电子交换能力逐渐增强，对曲美他嗪的氧化增强效应也更加显著。但是雕刻功率过高（如80%），石墨烯阵列电极更蓬松易脱落，其传感性能反而逐渐下降。以激光功率为70%制备的一体化石墨烯阵列电极为传感平台，构建了一种快速简便的曲美他嗪电化学检测方法，并成功用于人体尿液样品分析，展示出较好的准确性和实用性。研究结果成功拓展了曲美他嗪的检测方法，可为药品质量的监督评价以及体育赛事的兴奋剂检测提供理论。